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黄瓜花叶病毒(Cucumber mosiac virus,CMV)是一种分布范围最广、发生最普遍的植物RNA病毒之一,能侵染100科1200多种单、双子叶植物。在分类上属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridate)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus),其基因组由单链、正义RNA构成,包括RNA1、RNA2、RNA3和亚基因组RNA(RNA4),有的还含有卫星RNA(Satellite RNA),基因组结构简单,是研究RNA病毒致病机制的模式病毒之一.2b基因是近年来新发现的CMV基因组中与寄主植物相互作用的一个重要功能基因,其表达产物2b蛋白具有抑制转录后基因沉默的作用,其存在可能是CMV寄主范围广泛的重要原因之一。本论文就CMV的2b基因进行了以下方面的研究:
1、细菌双杂交诱饵质粒的构建与表达及自激活作用检测
构建CMV2b细菌双杂交诱饵质粒后,可通过从相应的文库中筛选与其相互作用的蛋白质,来对其功能进行分析。试验采用PCR法扩增2b基因编码区序列,将其克隆至带有λcI基因的pBT载体上,与λcI基因形成融合基因,获得pBT-CMV2b重组质粒。DNA测序结果表明,重组质粒中CMV2b编码区的碱基序列和阅读框均正确,pBT-CMV2b重组质粒(即诱饵质粒)构建成功。将诱饵质粒pBT-CMV2b转化大肠杆菌XL1-Blue MRF感受态细胞,在30℃培养条件下IPTG诱导重组融合蛋白表达。提取大肠杆菌的全细胞裂解产物,SDS-PAGE检测蛋白表达,无法判断CMV2b融合蛋白是否表达,经Western blot免疫印迹进一步鉴定,结果显示有CMV2b-λcI融合蛋白的表达。重组质粒pBT-CMV2b和空质粒pTRG共转化大肠杆菌XL1-Blue MRF报告菌株,在no3-AT平板及3-AT平板上37℃培养,观察菌落生长情况,并与阴性对照比较。结果显示,重组质粒pBT-CMV2b并无自主活化作用,可用于下一步的文库筛选实验。
2、λcI多克隆抗体的制备
λcI抗体可用于Western blot鉴定大肠杆菌双杂交系统诱饵质粒的表达。试验采用PCR法扩增λcI编码区序列,经双酶切将其定向克隆至表达载体pET-32b上,获得pET-32b-λcI重组表达质粒。DNA测序结果表明,重组质粒中λcI编码区的碱基序列和阅读框均正确;将重组质粒pET-32b-λcI转化大肠杆菌DE3感受态细胞,在20℃培养条件下IPTG诱导表达出可溶性蛋白。经过Ni2+-NTA柱纯化λcI蛋白后与弗氏佐剂混合免疫家兔,经ID-ELISA验证,得到了效价为1:25000的λcI抗血清,Western blot免疫印迹证实该抗体可用于大肠杆菌双杂交系统诱饵质粒的表达鉴定。
3、2b基因酵母双杂交诱饵质粒的构建与自激活作用检测
由于酵母双杂与细菌双杂的特点不同,2b酵母双杂交诱饵质粒在相应的cDNA文库中筛选到的互作蛋白可能与细菌双杂不同,据此可对2b功能进行补充分析。试验利用GatewayTM技术的λ嗜菌体位点特异重组系统,通过入门克隆载体介导将CMV2b基因引入载体pDESTTM32。通过BP重组反应将CMV2b基因引入入门克隆载体pDONRTM207,得到了pDONRTM207-CMV2b重组质粒。由于pDONRTM207与pDESTTM32具有相同的抗性筛选标记,无法按正常的将重组质粒pDONRTM207-CMV2b与pDESTTM32经LR位点特异的重组反应,通过抗性标记来筛选重组质粒pDESTTM32-CMV2b,因为很大部分未发生LR重组反应的pDONRTM207-CMV2b转化的菌也可以在相应的抗性平板上生长,正常很难筛选到重组质粒pDESTTM32-CMV2b。
对pDONRTM207-CMV2b序列进行酶切位点分析发现存在EcoRⅤ和BglⅡ两个酶切位点,可通过切割使抗性标记失活,而且离LR重组位点较远不会影响到它和pDESTTM32的LR重组反应。对重组质粒pDONRTM207-CMV2b用EcoRⅤ/BglⅡ进行双酶切后,再进行LR重组反应,在这种情况下的大部分重组子均含pDESTTM32-CMV2b,并经过DNA序列测定证明插入序列完全正确,无读码框移位,成功构建了pDESTTM32-CMV2b诱饵质粒。pDESTTM132-CMV2b与pDESTTM22共转化酵母MaV203感受态细胞,并设置不同对照,结果表明pDESTTM32-CMV2b具有弱的自激活作用,这种自激活可以被50-75mM浓度的3-AT所抑制,故可以用于下一步的文库筛选试验。