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山芝麻为梧桐科灌木,主要生长于东南亚地区,其味苦、性寒,可解表清热、解毒消肿。研究发现山芝麻根的水提物和醇提物具有降血糖、抗肿瘤、抗氧化及抗病毒功效,但对分离纯化后组分的生物活性研究少有报道。本文从优化山芝麻多糖提取工艺条件、分离纯化粗多糖、体外试验三个方面探究山芝麻多糖生物活性,为进一步探讨山芝麻多糖结构与功效的关系及其功能性食品、药品的开发奠定基础。主要工作如下: (1)运用响应面法优化山芝麻多糖的提取工艺 建立了以苯酚—硫酸法测定山芝麻多糖含量的测定方法。以山芝麻根粉末为原料、蒸馏水为提取剂,多糖提取率为考察指标,比较超声法提取和超声微波协同法提取山芝麻多糖。在单因素试验的基础上,设计响应面试验优化山芝麻多糖提取的工艺条件。超声法实验结果显示最佳提取工艺为:液料比32 mL/g、提取时间42 min、提取温度83℃,在此条件下进行三次试验,得到的山芝麻多糖平均提取率为7.67%。超声微波协同法提取山芝麻多糖的最佳工艺条件为:液料比32 mL/g、提取时间27 min、微波功率560W,此工艺条件下山芝麻多糖平均提取率为8.20%。超声微波协同法比超声法省时、高效,提取时间缩短了35.71%,多糖提取率提高了6.81%。 (2)对比多种分离介质效果确定了山芝麻多糖分离纯化条件 山芝麻粗多糖颜色较深,以脱色率和多糖损失率为评价指标,比较了活性炭、大孔树脂、双氧水-大孔树脂三种方法的脱色效果。结果表明,双氧水-大孔树脂法脱色效果最佳,脱色工艺条件为:大孔树脂用量15 g/100 mL、吸附时间3h、温度30℃、双氧水用量为6mL/100mL。在此条件下,三次脱色实验的平均脱色率为78.84%,多糖损失率为29.51%。以蛋白去除率和多糖损失率为考察指标,比较了Sevage法和Sevage-木瓜蛋白酶法的脱蛋白效果。结果表明,使用Sevage-木瓜蛋白酶脱除次数少,多糖损失少。通过考察酶用量、酶解时间、酶解温度对蛋白脱除的影响,Sevage-木瓜蛋白酶法脱除蛋白工艺条件:脱除次数为3次、酶用量为2%、酶解时间为60 min、酶解温度为50℃,平均蛋白脱除率为83.62%,多糖损失率为28.33%,是比较理想的脱除蛋白方法。 脱色、除蛋白处理后的山芝麻多糖(HALP),经DEAE-52离子交换、Sephadex G-300层析纯化得到山芝麻两个多糖组分为HALPs1-1和HALPs2-1。理化性质结果表明:HALP、HALPs1-1和HALPs2-1多糖含量分别为81.23%、94.45%、95.72%;糖醛酸含量分别为36.81%、23.62%、56.28%;山芝麻多糖不含有硫酸基。化学衍生结合HPLC分析表明HALPs1-1是一种葡聚糖,分子量为174.68 kDa,而HALPs2-1由葡萄糖醛酸组成,分子量为127.43 kDa。碘-碘化钾试验和红外光谱分析证明HALPs1-1和HALPs2-1具有典型的多糖类结构特征且属于酸性α型吡喃糖。通过扫描电镜(SEM)观察多糖形貌,粗多糖HALP的形貌为团簇状,而且多糖分布不均匀,说明粗多糖中还有其他杂质;组分HALPs1-1的形貌为骨架状,组分HALPs2-1的形貌为片层状。(3)从降血糖、抗氧化、抗炎活性等方面,探讨了山芝麻多糖体外生物活性 本试验以阿卡波糖为对照,比较同浓度下阿卡波糖片、山芝麻多糖HALP、组分HALPs1-1和组分HALPs2-1对α-葡萄糖苷酶的抑制率。结果表明,组分HALPs2-1对α-葡萄糖苷酶的抑制效果最佳,当浓度达到30 ug/mL时,组分HALPs1-1和组分HALPs2-1的抑制率高于阿卡波糖片。 以抗坏血酸(VC)为对照,通过体外抗氧化实验研究山芝麻多糖对ABTS、DPPH、OH自由基的清除能力。结果表明,组分HALPs2-1的抗氧化活性明显强于HALP和组分HALPs1-1,山芝麻多糖对DPPH、ABTS的自由基的清除能力与Vc接近。 采用脂多糖(LPS)刺激建立细胞体外炎症模型,研究山芝麻多糖的抗炎活性及多糖浓度对抗炎效果的影响。采用MTT方法测定细胞活力,测定570 nm处的吸光值(OD570),不同浓度多糖溶液对Caco-2细胞OD570值与对照组差异不明显,没有细胞毒性。研究山芝麻多糖对脂多糖(LPS)刺激的Caco-2细胞分泌TNF-γ、 TNF-α、IL-1β和IL-8的调节作用,山芝麻多糖能有效抑制TNF-γ、TNF-α、IL-1β和IL-8的过量分泌,体现了山芝麻多糖的体外抗炎作用。