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烟叶香气是衡量烟草质量和可用性的重要指标之一,其香味含量不足严重影响着烟草的品质,随着烟草工业的发展,提高烟草香气品质已成为急需解决的问题。萜类化合物是烟草主要香气物质的前体。1-脱氧木酮糖合酶(DXS)、1-脱氧木酮糖还原酶(DXR)和3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是萜类代谢途径中的关键基因,其中DXS和DXR基因来源于赤藓糖(MEP)途径,HMGR基因来源甲羟戊酸(MVA)途径,在烟草叶片中这些基因表达量的变化能直接或间接的影响萜类代谢途径,从而影响烟草香气前体物质的合成,最终影响烟草香气。另外,烟草作为模式植物,展开对烟草萜类代谢途径中相关酶的研究,可以为其它植物萜类化合物合成相关基因的研究提供线索和奠定理论基础。本文以栽培烟草“红花大金元”为实验材料,通过基因工程技术调控DXR基因和HMGR1基因的表达量,从而研究该基因在萜类代谢途径中的功能,为后续研究烟草香气物质形成的分子机理和烟草香味品质性状改良提供理论指导,同时为推进植物中萜类代谢途径的相关研究提供理论基础。本文主要研究结果如下:(1)在栽培烟草“红花大金元”中克隆了MEP途径的NtDXS、NtDXR两个基因和MVA途径中的NtHMGR1、NtHMGR2两个基因,并对其进行生物信息学分析。功能域预测结果表明:NtDXS蛋白中含有DXP_synthase_N、Transketolase_C和Transket_pyr结构域;NtDXR蛋白中有含有高度保守DXP_reductoisom和DXP_redisom_C功能结构域;NtHMGR1蛋白和NtHMGR2蛋白均有一个HMG-CoA_red保守结构域,是NADPH的结合位点。功能预测结果表明:NtDXS蛋白和NtDXR蛋白可能参与信号传导、转运、转录以及转录调控,另外,NtDXR蛋白还可能参与胁迫应答;NtHMGR1蛋白和NtHMGR2蛋白可能参与信号转导、电压门控离子通道、转录和转录调节。亚细胞定位预测结果表明:NtDXS和NtDXR定位在叶绿体,而NtHMGR1和NtHMGR2定位在细胞质。进化树和多序列比对结果表明:烟草中的该类基因与番茄中对应基因的相似性最高,并且发现烟草DXS和DXR同其它植物一样都含有一段细菌没有的质体转运肽。(2)对NtDXS/NtDXR/NtHMGR1/NtHMGR2基因在“红花大金元”中不同组织不同时期的表达量进行检测,结果表明NtDXS和NtDXR的表达模式相似,在幼苗和花中表达较高,在幼苗期根、茎和雄蕊中表达较低;NtHMGR1和NtHMGR2在成熟期的表达模式一致,在雌蕊中表达量较高,但是在幼苗期的表达模式差异较大。亚细胞定位实验结果表明NtDXR蛋白主要在叶绿体中并发挥作用。这些结果表明,NtDXS和NtDXR可能在植物不同部位具有相似的功能,而NtHMGR1和NtHMGR2虽然是同源基因,但可能参与植物不同的生命活动。(3)分别构建了NtDXR和NtHMGR1的超表达载体和CRISPR/Cas9敲除载体,通过农杆菌侵染、叶盘转化烟草,利用PCR和qRT-PCR两种方法鉴定阳性株系,最终获得NtDXR和NtHMGR1超表达T1代植株各10株,以及这两个基因的敲除植株各6株,其中3株NtDXR敲除植株叶片呈现白化表型。(4)利用GC-MS/MS气质联用及HPLC的方法对获得的NtHMGR1和NtDXR超表达转基因植株进行色素、甾醇、单萜、二萜、三萜等萜类化合物含量的测定。色素和甾醇测定结果表明:NtDXR和NtHMGR1超表达转基因烟草叶片中叶绿素a(Chla)、菜油甾醇、豆甾醇的含量都高于野生型,除此之外,NtDXR超表达转基因植株中羊毛甾醇、NtHMGR1超表达转基因植株中类胡萝卜素、β-谷甾醇含量也高于野生型。萜类化合物测定结果表明:在NtDXR超表达转基因植株中,二萜类的ɑ-4?8?13?-杜法三烯-13-二醇、β-4?8?13?-杜法三烯-13-二醇、松香醇、香紫苏醇、植醇和三萜类的β-香树素的含量较野生型升高,而在NtHMGR1超表达植株中,二萜中的松香醇、香紫苏醇的含量较野生型含量降低,倍半萜的t,t-法尼醇,二萜的植醇,三萜的β-香树素、角鲨烯含量较野生型含量升高。对NtDXR定点突变后植株呈白色的转基因株系进行色素代谢物测定,结果表明敲除植株中叶绿素a、叶绿素b和新黄质的含量都明显低于野生型。这些结果表明,NtDXR和NtHMGR1除了能共同影响叶绿素、菜油甾醇、豆甾醇的合成外,NtDXR主要影响二萜类物质的合成,NtHMGR1主要影响倍半萜、三萜类物质的合成。(5)利用qRT-PCR的方法对NtDXR和NtHMGR1超表达和敲除株系中MVA、MEP代谢途径中的基因表达量进行检测,结果显示:在NtDXR超表达转基因植株中,MVA代谢通路上游基因HMGR1、HMGR2、MK表达量降低;在NtDXR敲除植株中,HMGR1、HMGR2、MK、PMD基因表达量较野生型升高;在NtHMGR1超表达植株中,处于MEP代谢途径第二个关键酶基因DXR和该途径最下游的HDR基因表达量下降;在NtHMGR1敲除转基因植株中,DXR基因表达量上升,其下游基因HDS、HDR的表达量也有一定程度的升高。这些结果表明,MVA途径和MEP途径可能存在着相互抑制的作用。