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细胞酸化是其响应胁迫条件的基础性防御反应之一。这一过程的分子载体,除了质子泵之外,离子/质子逆向交换也是重要的机制。离子/质子逆向交换是由一类被称为CPA(Cation/Proton Antiport)的转运蛋白介导,按其主要运载的阳离子可分为Ca2+/H+(CHX)、Na+/H+(NHX)和K+/H+(KEA)等逆向转运系统。CPA普遍存在于几乎所有生物体内,然而人们对这一类运输/交换系统的了解还不够深刻。目前在高等生物中,有一些对CHX和NHX的描述,而长期以来对于KEA(K Efflux Antiporter)的功能特征和生理意义的认知,除了在细菌中有零星的报道之外,绝大部分尚为空白。
作者所在研究团队为揭示模式植物拟南芥中的6个K/H逆向转运系统(AtKEAs)的生理功能,设计了系统的研究计划。本论文作为该研究计划的先期探索部分,首先通过生物信息学手段寻找研究的切入点,探索旨在揭示KEA转运系统功能的方法和思路:研究了拟南芥中各KEA基因的表达部位及其对环境条件的响应;并通过启动子活性分析进一步明确了KEA基因的组织定位特征;最后通过。T-DNA插入突变体初步探讨了部分KEA的功能。
主要研究结果如下:
1.通过生物信息学分析了拟南芥,水稻,玉米,高粱,葡萄,短柄草,毛果杨7个植物物种KEA的同源和进化关系,发现KEA家族中的部分成员在物种进化过程中具有极高的保守性。另外研究了拟南芥AtKEA的蛋白质跨膜结构、关键结构域和亚细胞定位预测等。结果表明,AtKEA大多具有10-12个跨膜结构,是典型的膜蛋白,在跨膜区的N端有多个丝氨酸磷酸化调控位点;都含有K+/H+交换结构域和相应的调控域,推测其能够介导K+/H+交换。基因芯片研究表明,AtKEA在根、茎、叶、花和荚果等不同组织器官的表达丰度不同,表明KEA基因家族各成员的生理功能具有时空特异性。上述结果可为进一步深入研究植物K+/H+逆向转运系统的功能提供借鉴。
2.半定量RT-PCR表明,AtKEA1和AtKEA3主要在地上部表达,AtKEA2、AtKEA4、AtKEA5和AtKEA6在地上部和根部都有表达。所有6个基因在苗期和生殖生长期的表达特征一致。在不同供钾和pH持续处理条件下,AtKEAs的表达未见明显变化。另外在100μMCr3+和Ba2+持续处理条件下,AtKEA2、AtKEA4、AtKEA5、AtKEA6的表达略有增强。
3.克隆了6个AtKEAs基因的启动子序列,构建到植物表达载体中,通过农杆菌介导法成功获得转基因植株。目前完成了部分转基因拟南芥的promotor-GUS报告基因活性的组织化学定位分析。初步结果表明,幼苗期AtKEA1、2和3主要定位于叶片主脉和茎中;在生殖生长期,AtKEA1、2、3、4和6均定位于莲座叶叶柄和主脉、茎生叶与茎的节点处、荚果基部节点和子房等部位;值得注意的是,在叶片的机械切点(损伤处),GUS活性明显较高。4.在100mM NaCl胁迫条件下,AtKEAs T-DNA插入突变体对盐胁迫呈现出较强的抗性。WT生长受阻、叶片失绿黄化、根系严重受抑;而kea4-1,kea4-2,kea5-2则表现出明显的抗盐害能力。此外,kea4-1的植株含钾量高于WT,并且受活性氧影响较小。
上述结果表明,拟南芥KEA很可能是胁迫响应中的一个重要的主动防御机制,参与由机械损伤、重金属毒害和盐害等逆境条件诱发的活性氧清除。本文的研究结果为将来揭开KEA生理意义的面纱提供了有意义的方向性依据。