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肉毒神经毒素(Clostridium botulinum neurotoxin，BoNT)是肉毒梭状芽孢菌在厌氧环境中产生的一种外毒素，分7个血清型(A～G)，由神经毒部分(轻链)和非神经毒部分(重链)组成。肉毒毒素通过作用于神经突触感受器，抑制兴奋性神经递质的释放，引起松弛性神经麻痹。肉毒中毒是一种致死率很高的疾病，A、B、E型肉毒毒素是引起人类肉毒中毒的常见类型，F型偶尔引起食物中毒。因此，对肉毒毒素的防治研究具有重要的意义。各型BoNT分子均是呈二硫键连接的双链形式为：重链(heavy chain，HC)和轻链(light chain，LC)。结构功能研究表明，B型肉毒神经毒素(clostridium botulinum neurotoxin serotype B，BoNT/B)保护性抗原表位主要位于HC的羧基端(the carboxyl-terminal of the heavy chain of clostridium botulinumneurotoxin serotype B，BHc)上。因此，本实验通过克隆BHc基因，表达BHc，最后制备抗BHc的单克隆抗体，并筛选具有中和BoNT/B作用的单克隆抗体。
通过PCR从B型肉毒毒素基因组克隆BHc基因。将克隆到的基因连接T载体测序表明，克隆到的BHc基因与GenBank上的序列具有99％的同源性，说明克隆到的基因是BHc基因。将BHc5’端的基因进行修饰，替换掉稀有密码了后，将BHc基因克隆到pET22b(+)，在BL21(DE3)中表达。经SDS-PAGE和Westernblot鉴定，表明表达的BHc能被马抗BoNT/B特异性的识别。经过镍柱纯化和凝胶柱纯化，得到纯度90％以上的BHc。ELISA检测表明纯化到的BHc能与其受体sytⅡ特异的结合。将BHc免疫Babl/C小鼠，第三次免疫后采集血清，效价达到105，表明BHc具有好的免疫原性。攻毒实验表明经过BHc免疫的小鼠，能产生保护性的免疫应答。
BHc免疫的小鼠能在一定程度上免受BoNT/B的伤害。因此，BHc免疫小鼠血清效价达到105后，BHc加强免疫一次，第三天之后取其牌与SP2/0细胞融合。经过 HAT筛选及有限稀释克隆化之后，得到三株抗BHc的单克隆抗体。经protein G纯化得到纯度大于90％的单克隆抗体，效价达到105，亚类攀定表明所得到的单克隆抗体的亚型均为IgG1型。
为了鉴定筛选到的抗BHc单克隆抗体的阻断效果，将BoNT/B受体sytⅡ的基因克隆到pcDNA3.1/myc—his上，然后将质粒pcDNA3.1/myc—his—sytⅡ转染PC12细胞。加G418筛选，筛选单克隆细胞株。提取单克隆细胞株的总RNA，PCR鉴定sytⅡ基因的转录。Westernblot鉴定表明筛选到的PC12细胞系能表达sytⅡ。用FITC标记的标记BHc然后与筛选到的稳定表达sytⅡ的PC12细胞系孵育，荧光显微镜分析表明细胞被标记上了荧光，说明筛选得到的PC12细胞系可以作为单克隆抗体阻断实验的模型，将此PC12细胞系称为PC12-sytⅡ。细胞流式结果表明得到的三株单克隆抗体能阻断BHc与PC12-sytⅡ的结合。单克隆抗体的识别位点的实验表明，A1、A2识别相同的表位，而B1与A1、A2识别的位点是不一样的。单一抗体中和实验表明，筛选得到的单克隆抗体能显著延长小鼠的死亡时间，但并不能完全保护小鼠。而组合抗体的中和实验表明无论是A1与B1组合，还是A2与B1都能比单株单克隆抗体显著延长小鼠的死亡时间。说明本研究制备得到的单克隆抗体有一定的中和活性。ELISA检测显示筛选到的单克隆抗体能特异识别BoNT/B毒素。
本研究筛选到了能中和BoNT/B的单克隆抗体，这三株抗体能特异的识别BoNT/B，并且能一定程度上保护小鼠免受BoNT/B的伤害，为肉毒毒素的检测及抗毒素治疗提供了抗体，也为进一步制备高特异性，高亲和力，高中和效果的抗肉毒毒素抗体奠定了基础。