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第一部分成人原代肝细胞的分离、培养、冻存 目的:本研究主要目的是建立一种稳定的成人原代肝细胞分离、培养、冻存方法，为建立永生化肝细胞系提供充足的肝细胞来源，最终为肝细胞移植、生物人工肝支持系统治疗急慢性肝病以及肝细胞体外应用模型提供潜在的肝细胞资源。 方法:20例供肝采用离体两步胶原酶灌注技术分离成人原代肝细胞。7个预培养时间点(2h、6h、12h、24h、36h、48h和72h)被选择，在4℃人无血清培养基预培养12～24h后，肝细胞被使用海藻酸钠—多聚赖氨酸微球微囊化。然后，微囊肝细胞被转移到含10％DMSO的完全培养基中，再立即放入-80℃异丙醇冷冻盒过夜，次日投入液氮。预培养微囊冷冻组及其对照组肝细胞在解冻后白蛋白分泌、尿素合成、细胞周期、mRNA和蛋白表达水平，以及形态学和病理结构被分析。 结果:在部分肝叶切除后使用离体两步胶原酶灌流技术分离所得肝细胞活率和贴壁率分别是75.0±4.6％和72.0±6.0％。4℃预培养12或24h被证明是最适预培养时间(活率分别是61.4±4.8％和62.0±5.6％;贴壁率分别为3.2±5.8％和62.6±3.6％)，这两个时间点的白蛋白分泌高于其他时间点(P＜0.05)。与立即冷冻组(IC)相比较，我们发现贴壁细胞在mRNA和蛋白水平明显提高，以及解冻后更高的白蛋白和尿素合成水平。预培养微囊冷冻组(PMC)在贴壁培养冷冻/解冻后肝细胞的白蛋白合成与直接培养组肝细胞在第2、3和4天差异没有统计学意义。另外，与IC组相比较，PMC组在形态上保持的更为完整。 结论:部分肝叶切除后使用离体两步胶原酶灌注技术提供了一种创新、简单、可靠的肝细胞分离技术。本项研究结果表明人肝细胞在微囊化冷冻前4℃预培养12～24h可以更好的恢复形态和功能的完整性。这些研究结果为药理毒理学、生物人工肝以及细胞治疗的临床应用提供了可能性。 第二部分永生化肝细胞系的建立及其生物学特性研究 目的:建立一种由慢病毒载体表达人端粒酶反转录酶亚单位，高效、高分化永生化肝细胞系，为研究生物人工肝和肝细胞移植做准备，进一步揭示永生化肝细胞的生物学特性包括形态学、mRNA表达、蛋白表达和其他功能。 方法:采用离体两步胶原酶灌注法无菌条件下分离肝细胞。分别采用PA317乒乓反应、293T共转染的方法包装逆转录病毒，另外采用慢病毒载体包装慢病毒，比较三种方法所获病毒滴度。最后，肝细胞被采用表达永生化基因的高滴度慢病毒转染，其中含聚凝胺5 ug/ml并在37℃孵育12小时。筛选HNF4A基因阳性表达克隆建立永生化肝细胞系，其展示出高分化肝脏功能及永生化特性，并且被CK18免疫组化分析所证实。为了鉴定永生化肝细胞以便用于将来的细胞治疗，细胞转染后端粒酶活性、长度、增殖能力、形态学、肝细胞功能和致瘤性分别用免疫组化、RT-PCR、westemblotting、流式细胞分析和糖原染色等技术检测。 结果:采用HNF4A基因阳性表达筛选建立永生化肝细胞系，其可连续扩增传代，具有原代肝细胞的特性并未呈现致瘤性，包括分泌肝脏特异性蛋白及药物解毒特性。永生化肝细胞揭示出肝脏实质细胞的形态学特征、分泌白蛋白、合成尿素、葡萄糖并且表达肝脏富含的功能基因标志。 结论:我们通过HNF4A阳性表达筛选的方法成功建立了具有高分化特征的永生化肝细胞系，其有可能为研究分化细胞功能，解决供体器官短缺、肝细胞移植和生物人工肝支持系统提供有希望的策略。 第三部分:永生化肝细胞功能基因特性研究 目的:供体器官短缺已经促进了生物人工肝和肝细胞移植的发展。尽管最近的报道已经显示永生化肝细胞能够提供无限的肝细胞资源供给，其分化状态和表型的不稳定性限制了它的进一步临床应用。为了克服这个问题，有必要进一步研究永生化肝细胞肝脏分化的内在机制。HNF4A作为一种重要的核转录因子，对肝脏的胚胎发育和发展起重要作用。 方法:原代肝细胞被表达端粒酶亚单位的慢病毒转染，肝细胞被永生化并且随机挑取24个永生化肝细胞克隆，对其中的肝脏特异性基因(包括ALB、CYP2B6、 CYP3A4、CYP7A1、CEBPE、AGPR、HNF1A、HNF4A、HNF1B、HNF4G和C-MYC等功能基因)行RT-PCR水平分析。克隆并构建表达HNF4A基因的真核表达载体pcDNA3.1+HNF4A;同时设计可沉默HNF4A基因的shRNA寡核苷酸链并退火后连接到逆转录病毒载体，包装可稳定沉默HNF4A基因表达逆转录病毒。然后，HNF4A基因过表达和下调分别被作用于永生化肝细胞(HNF4A阴性表达)和原代肝细胞。 结果:通过对永生化肝细胞克隆基因表达分析发现HNF4A基因在永生化肝细胞功能、分化及致瘤性方面起重要作用。HNF4A基因被克隆并成功连接到pcDNA3.1+上并经测序验证正确，HNF4A过表达可明显增强白蛋白、细胞色素P4503A4及增强结合蛋白基因的表达，与肝脏分化相关的基因mRNA表达水平也增加3-5倍(p＜0.05)。然而，采用逆转录病毒载体构建包装小发夹RNA沉默原代肝细胞HNF4A表达显示出表型异常和染色体不稳定性。 结论:我们发现并证实了HNF4A表达可诱导永生化肝细胞高效分化，通过HNF4A基因阳性表达筛选可成功建立具原代肝细胞特征的高分化永生化肝细胞系。