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9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoiddioxygenase,NCED)催化9-顺式紫黄质或9-顺式新黄质裂解成为黄质醛是高等植物ABA生物合成的关键步骤。水分胁迫及其信号转导机制在拟南芥中已有广泛研究,但相关工作对农作物开展研究尚少,特别是农作物响应干旱信号与其NCED基因表达水平之间的关系及其机制仍有待阐明。迄今尚未有花生NCED基因克隆的报道,限制了对花生抗旱性与其体内NCED基因表达、ABA水平之间关系及其分子机制的了解。
本论文在分析了不同抗旱性品种花生粤油7(抗旱品种)和汕油523水分胁迫下的生理生化变化基础上,从抗旱品种叶片中克隆了花生NCED基因(AhNCED1),分析了AhNCED1基因在水分胁迫、高盐、低温及高温、外源ABA处理下的表达模式;并利用拟南芥129B08/nced3突变体异位表达研究花生AhNCED1基因的功能。主要结果如下:
水分胁迫后,与汕油523相比,抗旱品种粤油7叶片失水率和相对电导率较低,游离脯氨酸和内源ABA含量较高;植株整体水分状况好,细胞质膜相对稳定,渗透调节能力强,水分胁迫对植物体造成的伤害较小,品种的抗旱性与其体内AhNCED1mRNA和ABA水平呈平行关系。
从抗旱品种叶片克隆鉴定了花生AhNCED1基因,其cDNA全长2486bp,包含一完整开放阅读框,编码由601个氨基酸组成的多肽,分子量为66.86kDa,等电点8.39。序列分析表明,AhNCED1蛋白与已报道的NCEDs蛋白均有60%以上的同源性,C-端高度同源,N-端氨基酸同源性低但结构相似,N-端有一个典型的叶绿体靶向转运肽。
表达分析结果表明,水分胁迫、高盐能促进AhNCED1基因的表达。水分胁迫时,粤油7累积的AhNCED1mRNA水平高于汕油523;花生叶片和茎中积累AhNCED1mRNA。水分胁迫时花生叶片ABA含量的累积与AhNCED1mRNA累积相一致。外源ABA也促进了AhNCED1基因的表达。高温和低温对AhNCED1的表达无影响。萘普生和钨酸钠抑制AhNCED1表达。NAA通过增强AhNCED1基因的表达而提高内源ABA水平,萘普生和钨酸钠均抑制NAA的这种作用。
拟南芥129B08/nced3突变体在水分胁迫时不能累积ABA,对水分胁迫敏感。利用拟南芥异位表达分析AhNCED1基因的功能,结果表明,过表达AhNCED1基因拟南芥水分胁迫时积累ABA水平高;在129B08/nced3突变体中异位表达AhNCED1基因能回复该突变体对水分胁迫的超敏性(hypersensitivity),转基因突变体植株水分胁迫时积累大量ABA,对山梨醇、干旱的敏感性降低。外施ABA也能回复129B08/nced3突变体对山梨醇敏感的表型,进一步说明AhNCED1基因主要参与水分胁迫时ABA的生物合成。