Si-1基因结构与功能关系的研究

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Si-1基因是本实验室克隆的一个新的功能基因,它与细胞生长调控有密切的关系。前期的研究表明它在第15号外显子的56位碱基存在一个突变位点,该位点在肠癌中的分布频率较非肿瘤人群高,因此可能与肠癌的发生有关。但该基因的生物学功能至今不明确,本研究旨在通过对其结构与功能的关系研究,探讨其生物学功能。 本研究首先用GFP荧光定位确定了该基因所表达蛋白质定位在细胞核中;通过转基因后,用MTT法测定细胞的生长速度,结果显示转染Si-1基因的细胞其生长速度较对照细胞生长速度慢,表明Si-1基因对细胞生长有抑制作用;通过流式细胞分析的结果证明,与对照处理相比,转染Si-1基因后,S期细胞比例增加2.3倍,表明Si-1基因使细胞生长停止在S/G2控制点。 为了探讨该基因15号外显子的突变位点对该基因功能的影响,用PCR扩增突变与酶切/连接相结合的方法,构建了第15位外显子56号碱基由C到T的突变体。GFP荧光定位显示,野生型Si-1/GFP融合蛋白的荧光信号主要集中在细胞核内,而突变型Si-1/GFP融合蛋白的荧光信号均匀的分布在整个细胞;流式细胞分析测定显示,转染了突变型Si-1基因的S期细胞比例较野生型转染的小,而G2期细胞的比例较野生型基因转染细胞多:MTT测定结果也显示突变型基因转染细胞的生长速度较野生型的快,表明第15号外显子56位碱基的C-T变异体使其蛋白的功能部分丧失。该变异是一个有重要意义的变异位点,进一步支持它的变异与肠癌发生有关。 用入核信号预测软件NLSpredictonline预测该基因编码框的1206th-1239th为一入核信号编码序列。为了确证该序列与入核的关系,构建了一系列不同长短的半分子,与GFP基因融合表达,结果显示预测的入核信号(NSL)对蛋白入核没有明显的影响,而真正影响入核的不是几个氨基酸组成的短肽,而是一段约70个氨基酸组成的的肽段,编码框位于基因的1395th-1594th。根据蛋白质功能预测软件GOKey(1.0)分析表明,该多肽具有与DNA结合的可能性。由此推断该蛋白的核定位机制:Si-1基因编码蛋白可自由出入细胞核,进入细胞核的蛋白与核DNA结合,因而被固定在细胞核中,表现出核定位效应。GOKey(1.0)软件分析显示,Si-1基因编码产物是一个基因转录调控因子,结合该基因的核定位结果表明,该基因可能通过调节某些基因的表达水平而控制细胞的生长速度。 肿瘤是一类致病因素复杂的疾病,目前已有数百个基因可能与肿瘤有关,不同的肿瘤,同一种肿瘤不同的患者都有其不同的发病机制。本研究对一个新的肿瘤相关基因的结构和功能进行研究,对该基因与肿瘤关系的研究有重要的意义。
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