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背景:一氧化碳中毒(Carbon monoxide poisoning)是生活和生产中常见的中毒性疾病,严重危害人类的健康和生命,急性一氧化碳中毒患者经过及时抢救治疗,大多可以康复,但有部分患者在大约经历2-60日表现正常或基本正常的间歇期后,会再次出现一系列脑病的症状,称为一氧化碳中毒迟发性脑病,给病人家庭及社会带来沉重的经济负担。其主要表现为记忆受损、意识障碍、锥体外系神经障碍、锥体系神经损害等。其发病机制有多个学说,其中神经元凋亡是其重要机制之一。一氧化碳中毒迟发性脑病的治疗无特效方法,一直是困扰临床多年的难题,如何在一氧化碳中毒的早期进行积极有效的治疗,以减轻或防止一氧化碳中毒迟发性脑病,是医学界关注的重点。近年来的研究表明,胰岛素对局部脑缺血、全脑缺血及心肺复苏后大鼠均具有神经保护作用,胰岛素对急性一氧化碳中毒后脑损伤是否具有保护作用,未见系统研究。
目的:观察胰岛素对一氧化碳中毒后迟发性脑损伤大鼠学习、记忆能力,脑神经元凋亡及其调控蛋白Bcl-2,Caspase一3表达的影响,为临床防治一氧化碳中毒后迟发性脑损伤提供新的思路。
方法:采用腹腔注射3次CO气体法制备大鼠CO中毒模型,腹腔注射3次等量的空气作为对照组。将中毒后存活的大鼠随机分为CO中毒模型组(模型组,n=21只),CO中毒模型+胰岛素组(胰岛素组,n=21只)。胰岛素组给予1.2ml胰岛素葡萄糖溶液(2U/Kg胰岛素、2g/kg葡萄糖)快速腹腔注入,连续给药7天；模型组、对照组腹腔注射等剂量的生理盐水,连续7天。1.观察大鼠急性CO中毒后意识状态及肢体活动情况；2.监测大鼠中毒后0.5h、4h、4.5h的COHb浓度；3.采用Morris水迷宫检测各组大鼠1-5周逃避潜伏期； 4.应用尼氏染色,检测各组大鼠5周脑组织神经元形态； 5.用TUNEL法,检测各组大鼠5周神经元凋亡情况；6.应用免疫组化方法检测大鼠3天及5周脑组织抑凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Caspase-3蛋白的表达； 7检测腹腔注射胰岛素或生理盐水前后各组大鼠静脉血糖值。
结果:
1.染毒后大鼠的表现:大鼠腹腔注射CO气体后5-10min出现多动、烦躁；染毒20min后陆续出现少动、四肢瘫软、抽搐、昏迷,黏膜及肢端皮肤呈樱桃红色,部分发生角弓反张。中毒后8h左右大鼠恢复正常。
2.染毒后大鼠血COHb浓度的变化:大鼠中毒后0.5h血COHb浓度明显升高,最高达60％左右；中毒后4h,COHb浓度下降约25％。再次染毒后COHb浓度升至55％左右,保持浓度在48-67％之间达12h。
3.大鼠学习记忆功能的变化:CO中毒后1-5周Morris水迷宫检测发现,模型组逃避潜伏期(分别为74.77±7.72、65.6±22.52、50.03±33.52、39.31±35.4、29.54±37.14)明显长于对照组(分别为15.88±4.08、13.26±3.40、8.43±2.71、5.91±0.61、5.23±0.60)(P<0.05)；胰岛素组大鼠逃避潜伏期(分别为72.41±6.29、48.19±12.53、26.62±13.31、20.15±12.17、11.45±3.28)明显短于模型组(P<0.05)；至第3周,胰岛素组(26.62±13.31)与对照组逃避潜伏期(8.43±2.71)无差异(P>0.05)。
4.神经元变性情况:尼氏染色发现,模型组及胰岛素组海马CA1区、齿状回、皮层区均见神经元损伤及神经元脱失,胰岛素组神经损伤较模型组轻。
5.神经元凋亡情况:采用TUNEL法检测凋亡细胞,模型组及胰岛素组均见海马CA1区、齿状回、皮层区棕色阳性细胞,模型组海马CA1区、齿状回、皮层阳性细胞数(59.77±4.17、571.55±22.77、248.55±15.04)大于对照组(2.1±0.55、6.4±1.31、8.1±1.27)(P<0.05)；胰岛素组海马CA1区、齿状回、皮层阳性细胞数(50.40±1.14、207.30±11.87、53.20±4.77)低于模型组(P<0.05)。
6.大鼠海马CA1区、齿状回及皮层抑、促凋亡蛋白表达情况:中毒后3日,大鼠海马CA1区、齿状回及皮层区,模型组抑凋亡蛋白Bcl-2表达(5.3±0.67、17.67±4.17、15.3±1.53)较对照组(1.14±0.16、1.09±0.21、20.66±0.91)增加(P<0.05)；胰岛素组抑凋亡蛋白Bcl-2表达数值(10.56±1.18、29±5.65、41.9±2.19)较模型组增加(P<0.05)；模型组促凋亡蛋白Caspase-3表达(12.5±2.1、34.8±6.67、67.2±6.64)较对照组(2.63±0.52、17.6±4.17、15.3±1.53)增加(P<0.05)；胰岛素组促凋亡蛋白Caspase-3表达(7.29±1.52、16.71±5.6、51.2±4.03)较模型组减少(P<0.05)。中毒后5周,在大鼠海马CA1区和皮层区,模型组抑凋亡蛋白Bcl-2表达(5.13±1.19、50.1±7.08)较对照组(2.63±0.52、11.75±2.66)增加(P<0.05)；胰岛素组抑凋亡蛋白Bcl-2表达(10.3±1.13、81.00±5.23)较模型组增加(P<0.05)；模型组促凋亡蛋白Caspase-3表达(8.93±2.93、83.13±5.45)较对照组(1.88±0.64、22.13±1.96)增加(P<0.05)；胰岛素组促凋亡蛋白Caspase-3表达(5.07±0.88、39.13±2.44)较模型组减少(P<0.05)
7.外周血糖水平的变化:CO中毒后12h模型组(6.42±0.79)比对照组(5.01±0.5)血糖值升高；模型组与胰岛素组各时间点静脉血糖值无差异。
结论:
1.腹腔注射CO制备大鼠CO中毒迟发性脑损伤模型成功。
2.CO中毒迟发性脑损伤大鼠存在Morris水迷宫逃避潜伏期延长,海马CA1区、齿状回及皮层神经元变性、凋亡增加；抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低,促凋亡蛋白Caspase-3表达增加。
3.胰岛素能够降低大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期,抑制神经元凋亡,改善存活神经元细胞形态；增加海马CA1区、齿状回及皮层抑凋亡蛋白Bcl-2及降低促凋亡蛋白Caspase-3的表达,对大鼠CO中毒后迟发性脑损伤具有一定的神经保护作用。