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目的：肿瘤干细胞(CSCs)是肿瘤细胞中的一个小亚群，具有自我更新、分化和致瘤能力。对常规化疗和放疗有耐药性，极有可能是肿瘤转移的来源。因此，CSCs被认为是新型抗癌药物开发的重要靶点。糖原是葡萄糖在细胞内的储存形式，主要存在于骨骼肌和肝脏中。在肿瘤研究的过程中，糖原代谢一直是被大家忽视的一部分，只有部分数据显示，缺氧时肿瘤细胞糖原含量上升有利于肿瘤细胞的存活，但是糖原代谢具体在肿瘤及肿瘤干细胞中的作用并不十分清楚。本研究采用三维软纤维蛋白基质胶(3D fibrin)培养方法筛选和扩增肿瘤干细胞，定义为肿瘤再生细胞(tumor-repopulating cells, TRCs)，探究乳腺癌干细胞的糖原代谢水平，以及糖原代谢和其中间代谢产物在乳腺癌干细胞中的作用和具体机制。
方法：
(1)糖原含量的检测：通过高碘酸-雪夫(PAS)反应用组化方法检测人的不同正常组织中的糖原含量，人乳腺癌肿瘤和癌旁组织中的糖原含量以及八种人乳腺癌细胞系的糖原含量。将乳腺癌细胞系MCF-7种到软的3D纤维蛋白凝胶中，用电镜检测3D和2D细胞中糖原的含量。利用糖原检测试剂盒检测MCF-7、T47D和SUM159三种细胞系3D和2D细胞糖原的含量。
(2)糖原代谢相关酶的检测：利用real-timePCR和WesternBlot检测三种乳腺癌细胞系3D和2D细胞糖原代谢相关酶的表达。利用成球培养和ALDH分选试剂盒筛选乳腺癌干细胞，通过real-timePCR检测筛选出的乳腺癌干细胞和普通培养的乳腺癌细胞系的糖原相关酶的表达。
(3)敲降糖原代谢相关酶，观察TRCs克隆生长情况：使用siRNA分别敲降PYGL、GYS1、UGP2和PGM1后，观察MCF-7、T47D和SUM159TRCs克隆体积的变化。在敲降UGP2和PGM1的同时，外源性补充UDPG，观察MCF-7、T47D和SUM159TRCs克隆体积的变化。
(4)使用siRNA分别敲降UGP2和GYS1后，利用液相色谱-质谱联用检测MCF-7、T47D和SUM159TRCs细胞内的UDPG的表达。
(5)乳腺癌干细胞中P2Y14的表达情况：构建P2Y14-GFP过表达质粒载体，转染MCF-7、T47D和SUM159，48小时后利用共聚焦显微镜检测P2Y14的表达情况。利用real-timePCR和WesternBlot检测在MCF-7、T47D和SUM159的3D和2D细胞中P2Y14的表达。利用成球培养和ALDH分选试剂盒的方法筛选乳腺癌干细胞，并检测与普通培养的乳腺癌细胞系的P2RY14的表达差异。
(6)分析ALDH1A1与P2Y14的相关性：检索TCGA数据库分析乳腺癌患者中P2Y14与ALDH1A1的相关性。利用免疫荧光检测乳腺癌患者的石蜡切片中P2Y14与ALDH1A1的表达及分布情况。
(7)检测P2Y14对乳腺癌TRCs克隆生长的影响：使用siRNA敲降P2Y14后，再外源性补充UDPG，观察MCF-7、T47D和SUM159TRCs克隆体积的变化。使用P2Y14选择性抑制剂PPTN处理MCF-7、T47D和SUM159TRCs，在此基础上外源性补充UDPG，观察克隆体积的变化。构建慢病毒表达质粒pLVX-EF1α-AcGFP1-P2Y14，包慢病毒感染MCF-7、T47D和SUM159，用嘌呤霉素筛选后将细胞种到软的3D纤维蛋白凝胶中，观察克隆体积的变化。敲降GYS1的同时用PPTN阻断P2Y14的信号，观察乳腺癌TRCs克隆生长情况。
(8)UDPG释放到胞外过程的确定：分别用BrefeldinA或者siGM130阻断从高尔基体到内质网的转运，再通过外源补充UDPG，观察MCF-7、T47D和SUM159TRCs克隆体积的变化。利用real-timePCR检测MCF-7、T47D和SUM159三种细胞系3D和2D细胞核苷酸糖转运相关蛋白SLC35家族基因的表达。使用siRNA敲降SLC35A2、SLC35B2、SLC35C1、SLC35C2、SLC35G2和SLC35F5后，观察MCF-7、T47D和SUM159TRCs克隆体积的变化。敲降SLC35A2和SLC35F5后，外源性补充UDPG，观察MCF-7、T47D和SUM159TRCs克隆体积的变化。
(9)P2Y14下游信号通路的检测：分别使用PKA和PKC选择性抑制剂H89和Sotrastaurin处理MCF-7TRCs，观察克隆体积的变化。利用WesternBlot检测沉默和过表达P2Y14后TRCs中MAPK、NF-κB和Akt磷酸化水平的变化。利用WesternBlot检测分别沉默P2Y14或UGP2，再外源性补充UDPG之后ErK的磷酸化水平的变化。
(10)体内实验验证糖原代谢对乳腺癌进展的影响：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建分别稳定敲降P2Y14或UGP2的MCF-7细胞系，种到软的3D纤维蛋白凝胶中后接种到裸鼠皮下，观察成瘤情况。通过免疫组化分析了乳腺癌患者的肿瘤组织P2Y14表达水平，并分析P2Y14的表达和乳腺癌分期的相关性。
结果：
(1)PAS结果显示在人的正常组织中，肝脏、肌肉、肾脏、结肠和心脏的糖原含量相对较高，而乳腺、膀胱、皮肤、甲状腺和肺部的糖原含量相对较低。乳腺癌患者肿瘤部位糖原含量明显高于癌旁。不同乳腺癌细胞系中糖原含量不一样。电镜和糖原检测试剂盒结果均表明乳腺癌3D细胞中糖原含量明显高于2D细胞。这表明乳腺癌干细胞中糖原含量增多。
(2)MCF-7、T47D及SUM159的3D细胞中糖原合成和分解的酶的表达均高于2D细胞。成球培养和ALDH试剂盒筛选出的乳腺癌干细胞糖原合成酶的表达均高于普通培养的细胞。这表明乳腺癌干细胞糖原代谢流动加快。
(3)敲降PYGL对乳腺癌TRCs克隆生长无明显影响。敲降GYS1后，克隆生长明显增加。而敲降UGP2后，克隆生长明显受到抑制，外源补充UDPG后克隆生长明显得到恢复。敲降PGM1后，克隆生长明显受到抑制，外源补充UDPG后克隆生长明显得到恢复。提示可能是糖原代谢的中间产物UDPG促进了乳腺癌TRCs的生长。
(4)液相色谱-质谱联用结果显示敲降UGP2后TRCs胞内的UDPG含量下降，而敲降GYS1后TRCs胞内的UDPG含量上升。这一结果与敲降UGP2和GYS1后克隆生长趋势一致，更加印证了UDPG促进乳腺癌TRCs的生长的作用。
(5)共聚焦结果显示P2Y14表达在MCF-7、T47D和SUM159细胞膜上。real-timePCR和WesternBlot结果表明三种乳腺癌细胞系3D细胞P2Y14的表达均高于2D细胞。且成球培养和ALDH+流式分选所得乳腺癌干细胞P2RY14的基因表达明显高于普通培养的乳腺癌细胞系。这表明乳腺癌干细胞膜表面高表达P2Y14受体。
(6)数据库和免疫荧光结果表明乳腺癌患者中P2Y14与ALDH1A1在分布和表达上有非常明显的相关性。暗示P2Y14可能与乳腺癌干性相关。
(7)分别用siRNA或者抑制剂PPTN阻断P2Y14的信号以后，克隆生长明显受到抑制，外源补充UDPG后克隆生长并没有恢复。而过表达P2Y14后，克隆生长明显加快。同时PPTN能够逆转敲降GYS1介导的UDPG对乳腺癌TRCs生长的促进作用，siGYS1+PPTN组的克隆甚至小于siNC组。这表明UDPG通过激活P2Y14受体发挥促进乳腺癌TRCs生长的作用。
(8)UDPG能够部分逆转BrefeldinA和敲降MG130导致的TRCs的生长阻滞。Real-timePCR结果显示MCF-7、T47D和SUM1593D细胞内多种SLC35家族基因表达比2D细胞高。只有在敲降SLC35A2和SLC35F5后，克隆生长明显受到抑制，外源补充UDPG后克隆生长明显得到恢复。这表明糖原代谢产生的UDPG通过SLC35A2，SLC35F5和高尔基体依赖的方式分泌到细胞外。
(9)H89处理后克隆生长明显受到抑制，而Sotrastaurin处理后克隆生长无明显变化。敲降P2Y14后只有ErK的磷酸化水平明显受到抑制，过表达P2Y14后ErK的磷酸化水平增强。单独敲降P2Y14，再外源性补充UDPG之后，ErK的磷酸化水平无明显变化。但是单独敲降UGP2，再外源性补充UDPG之后，ErK的磷酸化水平明显得到恢复。这表明UDPG通过P2Y14-PKA-ErK信号通路促进乳腺癌TRCs的生长。
(10)敲降P2Y14和UGP2的乳腺癌TRCs在裸鼠皮下成瘤能力都减弱。同时乳腺癌晚期病人肿瘤组织内P2Y14高表达，并且与肿瘤组织Ki67的表达呈正相关趋势。这表明糖原代谢的中间代谢产物UDPG能够在体内影响乳腺癌的形成和发展。
结论：相较于已分化的乳腺癌细胞，乳腺癌干细胞中糖原含量增加，糖原代谢相关酶的表达也上升，糖原代谢更活跃。UDPG不仅参与糖原代谢，也是重要的细胞外信号分子，是P2Y14受体的激活剂，能够在体外影响乳腺癌TRCs的生长，在体内影响乳腺癌的形成和发展。其具体机制是：乳腺癌干细胞糖原代谢产生的UDPG能够通过SLC35A2和SLC35F5转运体进入高尔基体和内质网，再经由高尔基体依赖的分泌途径运送到细胞外，激活细胞膜表面的P2Y14受体，活化P2Y14-PKA-ErK信号通路，从而促进乳腺癌干细胞的生长。此外，TRCs中P2Y14的上调表达更加促进了这一过程。
方法：
(1)糖原含量的检测：通过高碘酸-雪夫(PAS)反应用组化方法检测人的不同正常组织中的糖原含量，人乳腺癌肿瘤和癌旁组织中的糖原含量以及八种人乳腺癌细胞系的糖原含量。将乳腺癌细胞系MCF-7种到软的3D纤维蛋白凝胶中，用电镜检测3D和2D细胞中糖原的含量。利用糖原检测试剂盒检测MCF-7、T47D和SUM159三种细胞系3D和2D细胞糖原的含量。
(2)糖原代谢相关酶的检测：利用real-timePCR和WesternBlot检测三种乳腺癌细胞系3D和2D细胞糖原代谢相关酶的表达。利用成球培养和ALDH分选试剂盒筛选乳腺癌干细胞，通过real-timePCR检测筛选出的乳腺癌干细胞和普通培养的乳腺癌细胞系的糖原相关酶的表达。
(3)敲降糖原代谢相关酶，观察TRCs克隆生长情况：使用siRNA分别敲降PYGL、GYS1、UGP2和PGM1后，观察MCF-7、T47D和SUM159TRCs克隆体积的变化。在敲降UGP2和PGM1的同时，外源性补充UDPG，观察MCF-7、T47D和SUM159TRCs克隆体积的变化。
(4)使用siRNA分别敲降UGP2和GYS1后，利用液相色谱-质谱联用检测MCF-7、T47D和SUM159TRCs细胞内的UDPG的表达。
(5)乳腺癌干细胞中P2Y14的表达情况：构建P2Y14-GFP过表达质粒载体，转染MCF-7、T47D和SUM159，48小时后利用共聚焦显微镜检测P2Y14的表达情况。利用real-timePCR和WesternBlot检测在MCF-7、T47D和SUM159的3D和2D细胞中P2Y14的表达。利用成球培养和ALDH分选试剂盒的方法筛选乳腺癌干细胞，并检测与普通培养的乳腺癌细胞系的P2RY14的表达差异。
(6)分析ALDH1A1与P2Y14的相关性：检索TCGA数据库分析乳腺癌患者中P2Y14与ALDH1A1的相关性。利用免疫荧光检测乳腺癌患者的石蜡切片中P2Y14与ALDH1A1的表达及分布情况。
(7)检测P2Y14对乳腺癌TRCs克隆生长的影响：使用siRNA敲降P2Y14后，再外源性补充UDPG，观察MCF-7、T47D和SUM159TRCs克隆体积的变化。使用P2Y14选择性抑制剂PPTN处理MCF-7、T47D和SUM159TRCs，在此基础上外源性补充UDPG，观察克隆体积的变化。构建慢病毒表达质粒pLVX-EF1α-AcGFP1-P2Y14，包慢病毒感染MCF-7、T47D和SUM159，用嘌呤霉素筛选后将细胞种到软的3D纤维蛋白凝胶中，观察克隆体积的变化。敲降GYS1的同时用PPTN阻断P2Y14的信号，观察乳腺癌TRCs克隆生长情况。
(8)UDPG释放到胞外过程的确定：分别用BrefeldinA或者siGM130阻断从高尔基体到内质网的转运，再通过外源补充UDPG，观察MCF-7、T47D和SUM159TRCs克隆体积的变化。利用real-timePCR检测MCF-7、T47D和SUM159三种细胞系3D和2D细胞核苷酸糖转运相关蛋白SLC35家族基因的表达。使用siRNA敲降SLC35A2、SLC35B2、SLC35C1、SLC35C2、SLC35G2和SLC35F5后，观察MCF-7、T47D和SUM159TRCs克隆体积的变化。敲降SLC35A2和SLC35F5后，外源性补充UDPG，观察MCF-7、T47D和SUM159TRCs克隆体积的变化。
(9)P2Y14下游信号通路的检测：分别使用PKA和PKC选择性抑制剂H89和Sotrastaurin处理MCF-7TRCs，观察克隆体积的变化。利用WesternBlot检测沉默和过表达P2Y14后TRCs中MAPK、NF-κB和Akt磷酸化水平的变化。利用WesternBlot检测分别沉默P2Y14或UGP2，再外源性补充UDPG之后ErK的磷酸化水平的变化。
(10)体内实验验证糖原代谢对乳腺癌进展的影响：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建分别稳定敲降P2Y14或UGP2的MCF-7细胞系，种到软的3D纤维蛋白凝胶中后接种到裸鼠皮下，观察成瘤情况。通过免疫组化分析了乳腺癌患者的肿瘤组织P2Y14表达水平，并分析P2Y14的表达和乳腺癌分期的相关性。
结果：
(1)PAS结果显示在人的正常组织中，肝脏、肌肉、肾脏、结肠和心脏的糖原含量相对较高，而乳腺、膀胱、皮肤、甲状腺和肺部的糖原含量相对较低。乳腺癌患者肿瘤部位糖原含量明显高于癌旁。不同乳腺癌细胞系中糖原含量不一样。电镜和糖原检测试剂盒结果均表明乳腺癌3D细胞中糖原含量明显高于2D细胞。这表明乳腺癌干细胞中糖原含量增多。
(2)MCF-7、T47D及SUM159的3D细胞中糖原合成和分解的酶的表达均高于2D细胞。成球培养和ALDH试剂盒筛选出的乳腺癌干细胞糖原合成酶的表达均高于普通培养的细胞。这表明乳腺癌干细胞糖原代谢流动加快。
(3)敲降PYGL对乳腺癌TRCs克隆生长无明显影响。敲降GYS1后，克隆生长明显增加。而敲降UGP2后，克隆生长明显受到抑制，外源补充UDPG后克隆生长明显得到恢复。敲降PGM1后，克隆生长明显受到抑制，外源补充UDPG后克隆生长明显得到恢复。提示可能是糖原代谢的中间产物UDPG促进了乳腺癌TRCs的生长。
(4)液相色谱-质谱联用结果显示敲降UGP2后TRCs胞内的UDPG含量下降，而敲降GYS1后TRCs胞内的UDPG含量上升。这一结果与敲降UGP2和GYS1后克隆生长趋势一致，更加印证了UDPG促进乳腺癌TRCs的生长的作用。
(5)共聚焦结果显示P2Y14表达在MCF-7、T47D和SUM159细胞膜上。real-timePCR和WesternBlot结果表明三种乳腺癌细胞系3D细胞P2Y14的表达均高于2D细胞。且成球培养和ALDH+流式分选所得乳腺癌干细胞P2RY14的基因表达明显高于普通培养的乳腺癌细胞系。这表明乳腺癌干细胞膜表面高表达P2Y14受体。
(6)数据库和免疫荧光结果表明乳腺癌患者中P2Y14与ALDH1A1在分布和表达上有非常明显的相关性。暗示P2Y14可能与乳腺癌干性相关。
(7)分别用siRNA或者抑制剂PPTN阻断P2Y14的信号以后，克隆生长明显受到抑制，外源补充UDPG后克隆生长并没有恢复。而过表达P2Y14后，克隆生长明显加快。同时PPTN能够逆转敲降GYS1介导的UDPG对乳腺癌TRCs生长的促进作用，siGYS1+PPTN组的克隆甚至小于siNC组。这表明UDPG通过激活P2Y14受体发挥促进乳腺癌TRCs生长的作用。
(8)UDPG能够部分逆转BrefeldinA和敲降MG130导致的TRCs的生长阻滞。Real-timePCR结果显示MCF-7、T47D和SUM1593D细胞内多种SLC35家族基因表达比2D细胞高。只有在敲降SLC35A2和SLC35F5后，克隆生长明显受到抑制，外源补充UDPG后克隆生长明显得到恢复。这表明糖原代谢产生的UDPG通过SLC35A2，SLC35F5和高尔基体依赖的方式分泌到细胞外。
(9)H89处理后克隆生长明显受到抑制，而Sotrastaurin处理后克隆生长无明显变化。敲降P2Y14后只有ErK的磷酸化水平明显受到抑制，过表达P2Y14后ErK的磷酸化水平增强。单独敲降P2Y14，再外源性补充UDPG之后，ErK的磷酸化水平无明显变化。但是单独敲降UGP2，再外源性补充UDPG之后，ErK的磷酸化水平明显得到恢复。这表明UDPG通过P2Y14-PKA-ErK信号通路促进乳腺癌TRCs的生长。
(10)敲降P2Y14和UGP2的乳腺癌TRCs在裸鼠皮下成瘤能力都减弱。同时乳腺癌晚期病人肿瘤组织内P2Y14高表达，并且与肿瘤组织Ki67的表达呈正相关趋势。这表明糖原代谢的中间代谢产物UDPG能够在体内影响乳腺癌的形成和发展。
结论：相较于已分化的乳腺癌细胞，乳腺癌干细胞中糖原含量增加，糖原代谢相关酶的表达也上升，糖原代谢更活跃。UDPG不仅参与糖原代谢，也是重要的细胞外信号分子，是P2Y14受体的激活剂，能够在体外影响乳腺癌TRCs的生长，在体内影响乳腺癌的形成和发展。其具体机制是：乳腺癌干细胞糖原代谢产生的UDPG能够通过SLC35A2和SLC35F5转运体进入高尔基体和内质网，再经由高尔基体依赖的分泌途径运送到细胞外，激活细胞膜表面的P2Y14受体，活化P2Y14-PKA-ErK信号通路，从而促进乳腺癌干细胞的生长。此外，TRCs中P2Y14的上调表达更加促进了这一过程。