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研究背景:头颈部鳞状细胞癌（Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）占头颈部恶性肿瘤的95%左右,是第6位常见的恶性肿瘤。60%以上的HNSCC患者确诊时已是Ⅲ期或Ⅳ期,虽经手术、化疗、放疗等多种方法的综合治疗,但是其5年生存率仍然不足50%。化疗有利于保留器官功能、提高局部控制率、减少远处转移和提高总生存期,目前主要用于HNSCC的化疗药物有:紫杉醇、顺铂和5-Fu等。然而,化疗常因固有的或获得性耐药而失败,进而导致肿瘤进展。且HNSCC具有异质性,因此预测化疗药物敏感性有助于个体化治疗,减轻患者负担。另外对肿瘤耐药机制进行研究,可通过逆转耐药提高化疗疗效。研究表明Notch1在多种肿瘤中高表达,并影响肿瘤的发生发展过程,且Notch1高表达可提示患者预后不良。另外研究还表明Notch1可以通过调控上皮-间充质转化和肿瘤干细胞表型参与化疗耐药。然而,Notch1与HNSCC化疗敏感性和进展之间的关系尚不完全清楚。我们前期研究发现HNSCC中Notch1的表达水平明显高于正常鳞状上皮,Notch1与HNSCC肿瘤原代细胞对顺铂的敏感性负相关。因此有必要通过体外实验和体内研究进一步揭示Notch1与HNSCC化疗敏感性的关系,研究高表达的Notch1在HNSCC进展中的作用及其与预后的关系。并对Notch1转录调控机制进行研究,以期通过调控Notch1表达来提高HNSCC的化疗敏感性,抑制肿瘤进展,为针对Notch1的靶向治疗研究提供理论依据。研究目的:1.通过体外实验和体内研究阐明Notch1表达与HNSCC化疗敏感性的关系。2.研究Notch1表达与HNSCC进展和预后的关系。3.分析Notch1启动子结构,研究HNSCC中Notch1的转录调控机制。研究方法:1.体外实验研究Notch1表达与HNSCC化疗敏感性的关系（1）收集HNSCC新鲜的癌组织,进行原代细胞培养,利用肿瘤原代细胞胶原凝胶体包埋化疗药敏检测技术（Collagen gel droplet embedded culture-drug sensitivity test,CD-DST）检测其对紫杉醇和5-Fu的化疗敏感性。（2）采用免疫组织化学技术检测Notch1蛋白在HNSCC癌组织中的表达,统计分析Notch1表达与体外化疗药物敏感性的关系。（3）选取人舌鳞癌细胞系Tb细胞和喉鳞癌原代细胞（Laryngeal squamous cell carcinoma primary cells,LSCC-PC）。免疫细胞化学检测细胞中 Notch1 的表达,CD-DST检测紫杉醇和顺铂的敏感性,利用Notch1信号通路阻断剂DAPT作用于Tb细胞和LSCC-PC细胞,CD-DST检测化疗敏感性的变化。2.体内研究Notch1表达与HNSCC化疗敏感性的关系（1）回顾性分析经诱导化疗的HNSCC患者的临床病例资料及随访资料,根据入选标准,分别筛选出接受TPF（紫杉醇+顺铂+5-Fu）和PF（顺铂+5-Fu）方案诱导化疗的患者,依据实体瘤RECIST（Response evaluation criteria in solid tumors,RECIST）评价诱导化疗反应。（2）通过免疫组织化学技术检测Notch1蛋白在HNSCC诱导化疗前癌组织中的表达水平。研究Notch1表达与诱导化疗反应之间的关系。（3）整理随访资料,绘制生存曲线,利用Log-rank检验Notch1表达水平不同的患者经TPF和PF两种方案诱导化疗后预后的差异。3.Notch1表达的临床意义（1）根据免疫组织化学染色评分结果,统计分析Notch1表达与患者临床病理指标之间的相关性。（2）统计分析Notch1表达与患者无进展生存期和总生存期的关系,研究Notch1表达对HNSCC患者预后的意义。4.体外研究Notch1对HNSCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响（1）通过慢病毒感染技术构建敲减Notch1的FaDu和CAL27细胞株,qRT-PCR检测Notch1敲除效果。（2）利用CCK-8细胞增殖实验、Transwell小室迁移和侵袭实验检测敲减Notch1对HNSCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。5.Notch1启动子结构分析及转录因子鉴定（1）构建Notch1启动子报告体和一系列缺失突变体。应用萤火虫荧光素酶活性实验比较各突变体的活性,确定Notch1核心启动子的位置。（2）应用PROMO软件预测Notch1核心启动子上可能结合的转录因子。（3）应用慢病毒感染技术构建稳定过表达Sp1的HNSCC细胞株。应用qRT-PCR技术检测Notch1 mRNA。将Notch1核心启动子报告体转染至未过表达Sp1和过表达Sp1的细胞株中,应用萤火虫荧光素酶活性实验检测Notch1核心启动子活性。结果:1.Notch1与HNSCC的体外化疗敏感性相关（1）HNSCC对紫杉醇和5-Fu的化疗敏感性不同。Notch1表达与HNSCC对紫杉醇的敏感性呈负相关。而Notch1表达与HNSCC对5-Fu的敏感性无相关性。（2）CD-DST结果显示:Tb细胞对紫杉醇和顺铂均敏感,DAPT可显著提高Tb细胞对紫杉醇和顺铂的敏感性。进一步选取了对紫杉醇和顺铂均耐药的LSCC-PC细胞进行实验,结果显示DAPT可逆转LSCC-PC对紫杉醇和顺铂的耐药。2.Notch1与HNSCC的体内诱导化疗反应相关（1）分析诱导化疗病例资料,TPF组诱导化疗有效率为68%,明显高于PF组（41%）。PF诱导化疗无效患者的Notchl表达水平明显高于化疗有效的患者。TPF诱导化疗无效患者的Notch1表达水平也明显高于化疗有效的患者。（2）TPF诱导化疗患者的总生存期明显优于PF诱导化疗的患者。为了研究Notch1是否通过影响化疗敏感性进而影响预后,将所有患者依据Notch1表达进行分层后分析,结果显示:在Notch1阴性表达的患者中,经TPF诱导化疗患者的总生存期明显优于经PF诱导化疗的患者。但是在Notch1阳性表达的患者中,经TPF诱导化疗患者的总生存期并不优于经PF诱导化疗的患者。3.Notch1与HNSCC的恶性进展有关,且Notch1阳性表达提示患者预后不良（1）根据免疫组织化学染色评分结果:HNSCC中Notch1阳性表达率为67%（65/97）。（2）Notch1表达与患者的T分期和淋巴结转移呈正相关。Notch1表达与其它临床病理指标之间未发现相关性。（3）在PF组中,Notch1 阳性表达患者的无进展生存期和总生存期均明显短于Notch1阴性表达的患者。在TPF组中,Notch1 阳性表达患者的无进展生存期和总生存期也均明显短于Notch1阴性表达的患者。（4）单因素生存分析显示淋巴结转移、T分期晚或Notch1阳性表达患者的无进展生存期和总生存期明显缩短。多因素生存分析结果显示Notch1表达是影响HNSCC患者无进展生存和总生存的独立相关危险因素。4.在FaDu细胞和CAL27细胞中敲减Notch1可抑制细胞的增殖、迁移和侵袭（1）与对照相比,感染Lv-shnotchl慢病毒可以明显下调FaDu细胞和CAL27细胞Notch1 mRNA的表达。（2）CCK-8实验结果显示:稳定敲减Notch1的FaDu细胞和CAL27细胞增殖活性明显下降。（3）Transwell实验结果显示:稳定敲减Notch1的FaDu细胞和CAL27细胞迁移和侵袭的细胞数量明显减少。5.Notch1的核心启动子和主要转录因子分析（1）构建Notch1启动子报告基因pGL3-notch1以及一系列缺失突变体,当启动子片段缩小到-70/+20时,与全长启动子（-1500/+20）相比仍有近66.34%的活性,表明Notch1核心启动子位于-70/+20区域。（2）通过PROMO软件共预测出3个可能与Notch1核心启动子结合的转录因子,分别是WT1、Pax-5和Sp1。（3）与对照相比,感染Lv-oeSp1慢病毒成功使CAL27细胞过表达Sp1。（4）qRT-PCR结果显示,过表达的Sp1可明显上调Notch1 mRNA水平。（5）启动子活性检测结果显示:过表达的Sp1可明显提高Notch1启动子活性。结论:1.Notch1表达与HNSCC对紫杉醇的敏感性负相关。Notch1信号通路阻断剂DAPT可提高HNSCC细胞对紫杉醇、顺铂的敏感性,并逆转其耐药。2.Notch1与HNSCC的恶性进展有关,且Notch1阳性表达患者的无进展生存期和总生存期明显缩短,Notch1可作为预测HNSCC患者预后的独立指标。3.TPF诱导化疗在化疗反应、预后方面均优于PF诱导化疗,但对于Notch1阳性表达的患者采用TPF诱导化疗并不优于PF。4.Notch1促进HNSCC细胞的增殖、迁移和侵袭。5.Notch1的核心启动子位于-70/+20区域,转录因子Sp1是Notch1的重要调控因子,在转录水平调控Notch1表达。