论文部分内容阅读
目的: 肌腱病常见于肌腱过度用力的人群，不仅在运动员中有很高的发病率，而且也常发生于非运动员的普通人群中。目前肌腱病的治疗面临两个重大难题:肌腱的钙化以及腱骨结合处断裂的修复。肌腱钙化是引起肌腱处疼痛和断裂的重要因素。肌腱钙化包括软骨化和骨化两种病理特征。由于对肌腱钙化病理机制研究的缺乏，目前仍缺少有效的预防和治疗肌腱钙化的方法。近期研究发现肌腱中存在具有多向分化潜能的肌腱干细胞，且预期其与肌腱钙化的形成相关。而且有研究发现力学刺激可以诱导干细胞的分化，而microRNA在干细胞的分化中具有重要作用。所以本课题在肌腱钙化方面，着力于力学感应的microRNA在肌腱干细胞异向分化导致肌腱钙化中作用的研究。而腱骨结合处断裂修复的难点在于普通的手术缝合或单一材质的生物支架无法促进腱骨结合处特殊结构——肌腱、纤维软骨到骨移形带的再生，无法保证修复后腱骨结合处力学强度的恢复。因此本课题在腱骨结合处断裂的修复方面，希望通过构建模拟腱骨结合处生理特征的新型生物支架来达到更好的修复效果。通过这两方面的研究，本课题希望可以解决肌腱病中的两个难点，对提高肌腱病的临床治疗效果有所贡献。 本课题通过力学刺激诱导肌腱干细胞成软骨—成骨分化的体外模型，模拟肌腱钙化在体内的形成。筛选相关microRNA，并研究其作用的分子机制，继而在肌腱钙化动物模型中检测相关microRNA作为治疗靶点的可行性，从而为肌腱钙化提供新的治疗靶点。构建并观察了两种新型生物支架在腱骨结合处断裂动物模型中的修复效果，为腱骨结合处临床修复提供更为有效的生物支架。 方法: 在研究肌腱钙化的分子机制方面，通过对大鼠肌腱干细胞施加不同拉伸幅度，不同加力时长的单向周期性拉应力后，运用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)，Western blot及分化相关染色和免疫组化检测成软骨—成骨分化指标，在四种加力模式中选择促进大鼠肌腱干细胞向成软骨—成骨分化的加力模式，模拟肌腱病中肌腱钙化的发生。然后通过microRNA芯片结合生物信息学分析，筛选出在力学刺激后呈现差异表达的microRNA，并通过Real-time PCR加以验证。通过靶基因预测软件结合基因功能分析选择了miR-337的靶基因，并通过荧光素酶报告基因系统和Western blot加以验证。在大鼠肌腱干细胞和人源肌腱干细胞中，利用Western blot验证miR-337通过靶向Nox4及其相关的成软骨分化基因表达和IRS1及其相关的成骨分化基因表达，影响肌腱干细胞的成软骨—成骨分化。对三维培养的大鼠肌腱干细胞施加力学刺激后，通过Real-time PCR，Western blot和免疫荧光检测miR-337及其靶基因和成软骨、成骨基因的变化，验证其结果是否与二维培养的大鼠肌腱干细胞受力学刺激时的所得到的结果一致。通过Real-time PCR和免疫组化，在肌腱病病人样本和大鼠肌腱钙化模型样本中验证肌腱钙化的产生是否与miR-337的表达下降和其靶基因的表达增加相关。将过表达miR-337的慢病毒用于Ⅰ型胶原酶诱导的大鼠肌腱钙化模型的治疗时，通过X-ray检测肌腱钙化情况，天狼星红染色结合偏正光显微镜观察Ⅰ型胶原再生及胶原纤维排列，免疫组化检测肌腱组织中分化相关基因的表达，验证miR-337作为肌腱病中肌腱钙化治疗靶点的可能性。分离大鼠肌腱钙化模型及miR-337治疗后的髌腱中的肌腱干细胞，通过Real-time PCR，Western blot和茜素红染色及甲苯胺蓝染色，验证miR-337的过表达是否通过影响肌腱干细胞的分化方向，从而起到治疗肌腱钙化的作用。 在腱骨结合处断裂的修复方面，构建了两种新型生物支架——生物陶瓷复合聚乳酸双相支架和三相丝素蛋白生物支架。生物陶瓷复合聚乳酸双相支架以纯聚乳酸材料为本底，在一端喷涂了生物陶瓷。无生物陶瓷一端用于与肌腱相连，喷涂了生物陶瓷一端与骨相连。三相丝素蛋白生物支架以丝素蛋白为本底，在一端复合了Ⅰ型胶原，与肌腱相连;另一端复合了羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)，与骨相连;中间添加了TGF-β的涂层用于促进纤维软骨的形成。在两种支架上培养大鼠肌腱干细胞，通过扫描电子显微镜观察和活死细胞染色，检测了两种支架的细胞相容性。通过免疫荧光染色检测大鼠肌腱干细胞成骨分化基因Runx2和成软骨分化基因Sox9的表达，通过Real-time PCR和Western blot检测分化相关基因的表达，验证两种支架表面的不同涂层对大鼠肌腱干细胞成骨和成软骨分化的影响。然后构建大鼠髌腱与胫骨间的腱骨结合处断裂模型，分别使用这两种支架连接肌腱与骨，修复腱骨结合处。手术8周后获取膝关节样本，通过力学强度检测，组织形态学检测验证两种材料的修复效果。 结果: 加力模式——10％拉伸幅度，0.5Hz的正弦波，每天8小时的单向周期性拉应力，可以促进大鼠肌腱干细胞向成软骨—成骨分化。在该加力模式下，大鼠肌腱干细胞中miR-337的表达下降。过表达miR-337不仅可以降低包含Nox4与IRS13非翻译区(3UTR)的报告基因的荧光素酶活性，还可以降低内源性的Nox4与IRS1的蛋白表达水平，说明Nox4和IRS1都是miR-337的直接靶基因。在大鼠肌腱干细胞和人源肌腱干细胞中，我们证明了Nox4可促进JNK-Sox9通路激活，IRS1可促进ERK-Runx2通路激活，从而促进肌腱干细胞的成软骨—成骨分化。大鼠肌腱干细胞的三维培养与二维培养相比，在相同的力学刺激条件下得到了一致的实验结果。我们在韧带钙化病人样本中发现了miR-337的表达下降，在肌腱病病人样本和大鼠肌腱钙化模型样本中发现了Nox4和IRS1的表达增加，与体外结果吻合。在大鼠肌腱钙化模型中髌腱处注射过表达miR-337的慢病毒，髌腱处的异位软骨-骨化减少，胶原纤维排列恢复规律性，证明了miR-337的表达升高可以有效治疗肌腱病中肌腱的钙化。注射过表达miR-337慢病毒的大鼠髌腱中提取的肌腱干细胞，其成软骨—成骨分化能力的减弱证明了过表达miR-337通过影响肌腱干细胞的分化而治疗肌腱钙化。 大鼠肌腱干细胞在生物陶瓷复合聚乳酸双相支架和三相丝素蛋白生物支架上都有良好的生长状态，显示出这两种生物支架具有良好的细胞相容性。生物陶瓷复合聚乳酸双相支架中的生物陶瓷涂层可以有效促进大鼠肌腱干细胞成骨分化;三相丝素蛋白生物支架中的TGF-β涂层和HA涂层可以有效诱导肌腱干细胞成软骨—成骨分化，从而促进纤维软骨和骨再生。生物陶瓷复合聚乳酸双相支架可以促进腱骨结合处纤维软骨细胞的产生，抑制血管化，促进腱骨结合处成骨基因OPN表达，从而促进腱骨结合处的修复。三相丝素蛋白生物支架复合外源大鼠肌腱干细胞修复髌腱与胫骨结合处时，得到更高的腱骨结合处力学强度，更清晰的移形带结构，相关分化基因表达增加的结果，证明了其对腱骨结合处的良好修复效果。 结论: 一方面，通过对肌腱病中肌腱钙化机制的研究，证明了miR-337在肌腱钙化中的作用及相关分子机制。以miR-337为靶点，在肌腱组织中过表达miR-337可以抑制大鼠肌腱病模型中的肌腱钙化。 另一方面，设计的两种新型生物支架——生物陶瓷复合聚乳酸双相支架和三相丝素蛋白生物支架，在大鼠髌腱与胫骨的腱骨结合处断裂模型中，通过促进纤维软骨和骨再生更好得修复腱骨结合处。 本研究不仅第一次阐明了力学感应的microRNA在肌腱钙化中的作用机制，而且证明了miR-337作为临床治疗肌腱钙化靶点的可能;两种新型生物支架的设计和功能验证为临床治疗腱骨结合处断裂提供了理论依据。通过这两个方面的研究，本课题寻找到了治疗肌腱病中两个难题的新方法。