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结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，在中国乃至全球其发病率居于第三，死亡率居于第二，具有“高发病率、高死亡率”的特点。
为了探讨BLVRA在结直肠癌中发生发展中的生物学行为，以及汉黄芩素能否通过抑制BLVRA达到治疗结直肠癌的作用。本文通过检测结直肠癌患者外周血及肿瘤组织中BLVRA表达水平发现其与结直肠癌的发生、发展密切相关。BLVRA与结肠癌细胞的恶化相关，且BLVRA的相关作用是通过调控Wnt/β-catenin信号通路发生的。汉黄芩素能够通过抑制BLVRA的表达，抑制结肠癌细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力，诱导CRC细胞的凋亡，抑制EMT进程。具体内容包括以下四个部分:
第一部分 BLVRA在结直肠癌患者中的表达水平及临床意义
目的:分析结直肠癌患者外周血及肿瘤组织中BLVRA的表达情况，探讨其与临床特征的相关性及生存期的关系。
方法:收集2015年至2017年扬州大学附属医院经病理确诊的110例结直肠癌患者外周血、活检肿瘤组织及癌旁组织，采用ELISA、qRT-PCR及免疫组化等方法检测BLVRA表达情况，采用卡方检验分析BLVRA的不同表达水平与患者的年龄、性别、发病部位、分期、分化程度、淋巴结及远处转移情况等临床病理特征的相关性，采用Kaplan-Meier法绘制BLVRA不同表达水平的PFS及OS生存曲线，采用对数秩检验比较不同BLVRA表达的累积无进展生存情况及累积总生存差异，分别以性别、年龄、发病部位、分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移、BLVRA表达为自变量，进行单因素及多因素COX回归分析。
结果:结直肠癌患者外周血中BLVRA的表达高于健康体检者，其在肿瘤组织及癌旁组织均有表达，但肿瘤组织中表达水平明显高于癌旁组织(P＜0.001)，且BLVRA高表达的患者PFS及OS更短(P＜0.001)。BLVRA的表达水平与患者分期、分化程度、淋巴结转移及远处转移相关(P＜0.001)，与患者年龄(P=0.881)、性别(P=0.143)及发病部位(P=0.387)无关。COX单因素分析显示患者分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移及BLVRA表达水平均与患者预后相关(P＜0.001)，而年龄(P=0.594)、性别(P=0.903)及发病部位(P=0.649)与患者预后无关。COX多因素分析表明患者分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移及BLVRA表达水平均与患者预后相关(P＜0.001)，而年龄(P=0.220)、性别(P=0.057)及发病部位(P=0.202)与患者预后无关。
结论:结直肠癌患者外周血及肿瘤组织中的BLVRA表达水平明显高于健康体检者及癌旁组织;BLVRA高表达的患者PFS及OS明显缩短，提示预后不良;肿瘤分期、分化程度、淋巴结和远处转移及BLVRA表达水平是影响结直肠癌患者不良预后的独立因素。
第二部分 BLVRA对结肠癌细胞生物学行为的影响
目的:构建BLVRA敲低及过表达载体，体外实验探讨其对结肠癌HT-29及SW620细胞增殖能力、细胞凋亡、迁移和侵袭及上皮-间质转化的影响。
方法:首先采用qRT-PCR及Westem blot法检测结肠癌细胞株HT-29、SW620、SW480、HCT116、LOVO及正常肠上皮细胞FHC中BLVRA mRNA及蛋白表达水平;构建BLVRA敲低及过表达载体和各自的阴性对照载体，进行细胞转染，qRT-PCR及Western blot检测转染后BLVRA mRNA及蛋白水平，证实BLVRA敲低及过表达细胞株成功建立;采用MTT、流式细胞术、Transwell、免疫荧光、Westem blot等方法检测细胞增殖能力、细胞凋亡率及细胞凋亡因子蛋白水平、细胞迁移和侵袭能力及上皮，间质转化(EMT)相关蛋白的变化。
结果:qRT-PCR及Western blot结果均显示五株结肠癌细胞株中HT-29细胞的BLVRA mRNA及蛋白表达水平最高(P＜0.01)，SW620细胞的BLVRA mRNA及蛋白表达水平最低(P＜0.05)，选择HT-29及SW620细胞进行后续实验;细胞转染后qRT-PCR及Westem blot结果显示HT-29细胞中BLVRA mRNA及蛋白表达降低(P＜0.O01)，SW620细胞中BLVRA mRNA及蛋白表达升高(P＜0.001);敲低BLVRA后MTT结果显示HT-29细胞增殖能力降低，且随着时间延长，作用明显(P＜0.001)，流式细胞术提示细胞凋亡率增加(P＜0.001)，Western blot提示抗凋亡因子Bcl-2及survlVln的蛋白水平降低(P＜0.05)，促凋亡因子BAX及Caspase-7的蛋白水平增加(P＜0.05)，Transwell结果显示细胞迁移和侵袭数目明显下降(P＜0.001)，免疫荧光及Westem blot均显示E-Cadherin表达升高，Vimentin表达下降(P＜0.05);过表达BLVRA后MTT结果显示SW620细胞增殖能力提高，且随着时间延长增殖明显(P＜0.001)，流式细胞术提示细胞凋亡率降低(P＜0.001)，Westem blot提示抗凋亡因子Bcl-2及survlvln的蛋白水平升高(P＜0.05)，而促凋亡因子BAX及Caspase-7的蛋白水平降低(P＜0.05)，Transwell结果显示细胞迁移和侵袭数目明显增加(P＜0.001)，免疫荧光结果显示E-Cadherin表达下降，Vimentin表达上升，Western blot显示出一致的结果(P＜0.05)。
结论:结肠癌细胞株中BLVRA表达水平均高于正常肠上皮细胞;siRNA-BLVRA能够抑制HT-29细胞的增殖能力、促进细胞凋亡、抑制细胞的迁移和侵袭能力，并通过抑制上皮-间充质转化(EMT)进程来进一步弱化CRC细胞的迁移和侵袭能力，而BLVRA过表达在SW620细胞中则起着相反的生物学作用。
第三部分 BLVRA影响结肠癌细胞生物学行为的初步机制探讨
目的:探讨BLVRA是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路发生作用。
方法:采用Western blot检测转染前后结肠癌细胞中Wnt/β-catenin通路及其靶蛋白的表达变化;加予该通路抑制剂(IWR-1)及激动剂(CHIR98014)干预后Western blot检测Wnt/β-catenin通路及其靶蛋白的表达变化。
结果:BLVRA敲低后Wnt5a及β-catenin蛋白表达水平下降(P＜0.01)，p-β-catenin蛋白表达水平上升(P＜0.01)，靶蛋白cyclin D1、C-myc、p-GSK-3β、COX-2表达下降(P＜0.05)，p-PTEN表达水平增加(P＜0.05)，激动剂干预后起着相反的作用(P＜0.05):BLVRA过表达后上调Wnt5a、β-catenin(P＜0.01)及靶蛋白cyclin D1、C-myc、p-GSK-3β、COX-2的表达(P＜0.05)，降低p-β-catenin(P＜0.01)及靶蛋白p-PTEN(P＜0.05)的表达，抑制剂干预后则起着相反的作用(P＜0.05)。
结论:siRNA-BLVRA能够抑制Wnt/β-catenin通路，激动剂干预后再次激活Wnt/β-catenin通路;BLVRA过表达则能激活Wnt/β-catenin通路，抑制剂干预后再次抑制Wnt/β-catenin通路，提示BLVRA是通过调控Wnt/β-catenin通路发生作用的。
第四部分 汉黄芩素调控BLVRA抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭及诱导凋亡的机制研究
目的:探讨汉黄芩素对结肠癌HT-29及SW620细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡及EMT进程的影响，并探讨其是否通过调控BLVRA发生作用。
方法:取对数生长期的HT-29和SW620细胞，加入不同浓度的汉黄芩素(0，20，40，80，160μg/mL)，并设立5-FU（12.5μg/mL）为阳性对照组，采用MTT法检测汉黄芩素及5-FU对结肠癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测汉黄芩素及5-FU对结肠癌细胞凋亡的影响;通过Transwell实验检测汉黄芩素及5-FU对结肠癌细胞迁移和侵袭的影响;Westem blot检测细胞凋亡因子Bcl-2、BAX及EMT相关蛋白E-Cadherin、Vimentin及snail的变化。
结果:汉黄芩素抑制结肠癌细胞的增殖能力，且呈现时间及浓度依赖性(P＜0.01);汉黄芩素能够提高结肠癌细胞凋亡率，抑制抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表达，增加促凋亡因子BAX蛋白的表达水平，且随着汉黄芩素浓度的增加作用明显(P＜0.01);汉黄芩素能够抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭能力，且呈现浓度依赖性(P＜0.01):Western blot结果显示汉黄芩素能够增加E-Cadherin的表达，降低Vimentin及snail蛋白的表达水平，且呈现浓度依赖性(P＜0.05);汉黄芩素素能降低两种CRC细胞中BLVRA的蛋白表达水平，并且与浓度相关(P＜0.05)。
结论:汉黄芩素能够抑制结肠癌HT-29和SW620细胞的增殖、迁移和侵袭能力，诱导细胞凋亡，抑制上皮一间充质转化(EMT)进程，且呈浓度依赖性，其作用可能是通过调控BLVRA的表达产生的。
为了探讨BLVRA在结直肠癌中发生发展中的生物学行为，以及汉黄芩素能否通过抑制BLVRA达到治疗结直肠癌的作用。本文通过检测结直肠癌患者外周血及肿瘤组织中BLVRA表达水平发现其与结直肠癌的发生、发展密切相关。BLVRA与结肠癌细胞的恶化相关，且BLVRA的相关作用是通过调控Wnt/β-catenin信号通路发生的。汉黄芩素能够通过抑制BLVRA的表达，抑制结肠癌细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力，诱导CRC细胞的凋亡，抑制EMT进程。具体内容包括以下四个部分:
第一部分 BLVRA在结直肠癌患者中的表达水平及临床意义
目的:分析结直肠癌患者外周血及肿瘤组织中BLVRA的表达情况，探讨其与临床特征的相关性及生存期的关系。
方法:收集2015年至2017年扬州大学附属医院经病理确诊的110例结直肠癌患者外周血、活检肿瘤组织及癌旁组织，采用ELISA、qRT-PCR及免疫组化等方法检测BLVRA表达情况，采用卡方检验分析BLVRA的不同表达水平与患者的年龄、性别、发病部位、分期、分化程度、淋巴结及远处转移情况等临床病理特征的相关性，采用Kaplan-Meier法绘制BLVRA不同表达水平的PFS及OS生存曲线，采用对数秩检验比较不同BLVRA表达的累积无进展生存情况及累积总生存差异，分别以性别、年龄、发病部位、分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移、BLVRA表达为自变量，进行单因素及多因素COX回归分析。
结果:结直肠癌患者外周血中BLVRA的表达高于健康体检者，其在肿瘤组织及癌旁组织均有表达，但肿瘤组织中表达水平明显高于癌旁组织(P＜0.001)，且BLVRA高表达的患者PFS及OS更短(P＜0.001)。BLVRA的表达水平与患者分期、分化程度、淋巴结转移及远处转移相关(P＜0.001)，与患者年龄(P=0.881)、性别(P=0.143)及发病部位(P=0.387)无关。COX单因素分析显示患者分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移及BLVRA表达水平均与患者预后相关(P＜0.001)，而年龄(P=0.594)、性别(P=0.903)及发病部位(P=0.649)与患者预后无关。COX多因素分析表明患者分期、分化程度、淋巴结转移、远处转移及BLVRA表达水平均与患者预后相关(P＜0.001)，而年龄(P=0.220)、性别(P=0.057)及发病部位(P=0.202)与患者预后无关。
结论:结直肠癌患者外周血及肿瘤组织中的BLVRA表达水平明显高于健康体检者及癌旁组织;BLVRA高表达的患者PFS及OS明显缩短，提示预后不良;肿瘤分期、分化程度、淋巴结和远处转移及BLVRA表达水平是影响结直肠癌患者不良预后的独立因素。
第二部分 BLVRA对结肠癌细胞生物学行为的影响
目的:构建BLVRA敲低及过表达载体，体外实验探讨其对结肠癌HT-29及SW620细胞增殖能力、细胞凋亡、迁移和侵袭及上皮-间质转化的影响。
方法:首先采用qRT-PCR及Westem blot法检测结肠癌细胞株HT-29、SW620、SW480、HCT116、LOVO及正常肠上皮细胞FHC中BLVRA mRNA及蛋白表达水平;构建BLVRA敲低及过表达载体和各自的阴性对照载体，进行细胞转染，qRT-PCR及Western blot检测转染后BLVRA mRNA及蛋白水平，证实BLVRA敲低及过表达细胞株成功建立;采用MTT、流式细胞术、Transwell、免疫荧光、Westem blot等方法检测细胞增殖能力、细胞凋亡率及细胞凋亡因子蛋白水平、细胞迁移和侵袭能力及上皮，间质转化(EMT)相关蛋白的变化。
结果:qRT-PCR及Western blot结果均显示五株结肠癌细胞株中HT-29细胞的BLVRA mRNA及蛋白表达水平最高(P＜0.01)，SW620细胞的BLVRA mRNA及蛋白表达水平最低(P＜0.05)，选择HT-29及SW620细胞进行后续实验;细胞转染后qRT-PCR及Westem blot结果显示HT-29细胞中BLVRA mRNA及蛋白表达降低(P＜0.O01)，SW620细胞中BLVRA mRNA及蛋白表达升高(P＜0.001);敲低BLVRA后MTT结果显示HT-29细胞增殖能力降低，且随着时间延长，作用明显(P＜0.001)，流式细胞术提示细胞凋亡率增加(P＜0.001)，Western blot提示抗凋亡因子Bcl-2及survlVln的蛋白水平降低(P＜0.05)，促凋亡因子BAX及Caspase-7的蛋白水平增加(P＜0.05)，Transwell结果显示细胞迁移和侵袭数目明显下降(P＜0.001)，免疫荧光及Westem blot均显示E-Cadherin表达升高，Vimentin表达下降(P＜0.05);过表达BLVRA后MTT结果显示SW620细胞增殖能力提高，且随着时间延长增殖明显(P＜0.001)，流式细胞术提示细胞凋亡率降低(P＜0.001)，Westem blot提示抗凋亡因子Bcl-2及survlvln的蛋白水平升高(P＜0.05)，而促凋亡因子BAX及Caspase-7的蛋白水平降低(P＜0.05)，Transwell结果显示细胞迁移和侵袭数目明显增加(P＜0.001)，免疫荧光结果显示E-Cadherin表达下降，Vimentin表达上升，Western blot显示出一致的结果(P＜0.05)。
结论:结肠癌细胞株中BLVRA表达水平均高于正常肠上皮细胞;siRNA-BLVRA能够抑制HT-29细胞的增殖能力、促进细胞凋亡、抑制细胞的迁移和侵袭能力，并通过抑制上皮-间充质转化(EMT)进程来进一步弱化CRC细胞的迁移和侵袭能力，而BLVRA过表达在SW620细胞中则起着相反的生物学作用。
第三部分 BLVRA影响结肠癌细胞生物学行为的初步机制探讨
目的:探讨BLVRA是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路发生作用。
方法:采用Western blot检测转染前后结肠癌细胞中Wnt/β-catenin通路及其靶蛋白的表达变化;加予该通路抑制剂(IWR-1)及激动剂(CHIR98014)干预后Western blot检测Wnt/β-catenin通路及其靶蛋白的表达变化。
结果:BLVRA敲低后Wnt5a及β-catenin蛋白表达水平下降(P＜0.01)，p-β-catenin蛋白表达水平上升(P＜0.01)，靶蛋白cyclin D1、C-myc、p-GSK-3β、COX-2表达下降(P＜0.05)，p-PTEN表达水平增加(P＜0.05)，激动剂干预后起着相反的作用(P＜0.05):BLVRA过表达后上调Wnt5a、β-catenin(P＜0.01)及靶蛋白cyclin D1、C-myc、p-GSK-3β、COX-2的表达(P＜0.05)，降低p-β-catenin(P＜0.01)及靶蛋白p-PTEN(P＜0.05)的表达，抑制剂干预后则起着相反的作用(P＜0.05)。
结论:siRNA-BLVRA能够抑制Wnt/β-catenin通路，激动剂干预后再次激活Wnt/β-catenin通路;BLVRA过表达则能激活Wnt/β-catenin通路，抑制剂干预后再次抑制Wnt/β-catenin通路，提示BLVRA是通过调控Wnt/β-catenin通路发生作用的。
第四部分 汉黄芩素调控BLVRA抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭及诱导凋亡的机制研究
目的:探讨汉黄芩素对结肠癌HT-29及SW620细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡及EMT进程的影响，并探讨其是否通过调控BLVRA发生作用。
方法:取对数生长期的HT-29和SW620细胞，加入不同浓度的汉黄芩素(0，20，40，80，160μg/mL)，并设立5-FU（12.5μg/mL）为阳性对照组，采用MTT法检测汉黄芩素及5-FU对结肠癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测汉黄芩素及5-FU对结肠癌细胞凋亡的影响;通过Transwell实验检测汉黄芩素及5-FU对结肠癌细胞迁移和侵袭的影响;Westem blot检测细胞凋亡因子Bcl-2、BAX及EMT相关蛋白E-Cadherin、Vimentin及snail的变化。
结果:汉黄芩素抑制结肠癌细胞的增殖能力，且呈现时间及浓度依赖性(P＜0.01);汉黄芩素能够提高结肠癌细胞凋亡率，抑制抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表达，增加促凋亡因子BAX蛋白的表达水平，且随着汉黄芩素浓度的增加作用明显(P＜0.01);汉黄芩素能够抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭能力，且呈现浓度依赖性(P＜0.01):Western blot结果显示汉黄芩素能够增加E-Cadherin的表达，降低Vimentin及snail蛋白的表达水平，且呈现浓度依赖性(P＜0.05);汉黄芩素素能降低两种CRC细胞中BLVRA的蛋白表达水平，并且与浓度相关(P＜0.05)。
结论:汉黄芩素能够抑制结肠癌HT-29和SW620细胞的增殖、迁移和侵袭能力，诱导细胞凋亡，抑制上皮一间充质转化(EMT)进程，且呈浓度依赖性，其作用可能是通过调控BLVRA的表达产生的。