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研究背景和目的
宫颈癌居我国妇科肿瘤发病第一位、死亡第一位。目前认为，一系列的促癌基因(oncogenes)过度表达和活化是宫颈癌发生、发展的主要原因。赖氨酸乙酰转移酶(lysine acetyltransferases，KATs)具有组蛋白乙酰化作用，对染色体的结构和功能至关重要。在编码KATs的基因中，KAT6B是一个非常重要的肿瘤驱动基因，其扩增在多种肿瘤中发现，比如宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肠癌等。越来越多的研究发现，宫颈癌中磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)低表达者预后更差。但是，KAT6B、AMPK信号通路在宫颈癌发展中的作用尚未明确。
本项目拟运用分子、细胞生物学等方法，研究KAT6B在宫颈癌发展中的作用及KAT6B-AMPKα在宫颈癌发展中相关信号机制。进一步研究KAT6B在宫颈癌患者中表达及对临床预后的影响。探讨宫颈癌治疗新的潜在靶点(KAT6B-AMPKα)。
研究方法及材料
首先，收集江苏大学附属昆山医院手术切除的未做任何放疗、化疗的新鲜原发宫颈癌标本6例，PCR检测组织中KAT6B表达情况，并运用westernblot方法检测宫颈癌组织中KAT6B、AMPKα表达情况。
随后，从上海生命科学研究院购买人宫颈癌Hela、C33a细胞株，分别转染siRNA、CRISPR/Cas9-KO及过表达(over expression)KAT6B病毒，建立不同KAT6B表达、稳转的宫颈癌细胞株。采用显微镜下每日记录细胞数量、克隆形成实验以研究各组细胞生长情况;运用EdU方法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞周期;运用细胞划痕实验、transwell实验研究各组细胞迁移，Matrigeltranswell实验检测细胞侵袭。Westernblot检测KAT6B、AMPKα和磷酸化的AMPKα、磷酸化的AKT及mTOR、S6和磷酸化的S6，并检测相关生长因子受体EGFR、PDGFRα、PDGFRβ等信号通路的改变。
最后，收集江苏大学附属昆山医院活检及手术切除的未做任何放疗、化疗的宫颈癌标本(新鲜及石蜡包埋)119例，取手术周边正常组织(35例)作为对照，运用免疫组化方法检测宫颈癌组织及正常宫颈组织中KAT6B表达，并分析其与宫颈癌病理类型、分期、分级、预后等临床指标的相关性。进一步研究KAT6B在宫颈癌发展中的作用。
细胞种板的数量、试剂的浓度及具体实验方法基于发表文献和预实验的结果。
统计学处理
在每次细胞学实验中，至少设置3个副孔，并且每个实验至少重复3次。使用SPSS22.0及GraphPadprism7.0软件进行分析统计及作图，并运用one-wayANOVA，Scheffe和Tukey检验、Chi-square检验、Kaplan-Meier法和COX回归分析等方法分析实验数据。P＜0.05被认为有统计学意义。
研究结果
1.宫颈癌组织中KAT6B相比正常宫颈组织表达增加。收集江苏大学附属昆山医院手术切除的未做任何放疗、化疗的新鲜原发宫颈癌标本6例，PCR检测组织中KAT6BmRNA水平，结果发现宫颈癌组织中的mRNA水平较周围正常组织明显增加。进一步运用westernblot方法检测宫颈癌组织及正常组织中KAT6B及AMPKα蛋白表达水平，发现宫颈癌组织中KAT6B、EGFR、PDGFRα蛋白表达明显增加。AMPKα则较正常组织相比减少，但无统计学意义。
2.KAT6B促进宫颈癌细胞生长、增殖、迁移、侵袭。建立不同KAT6B表达、稳转的宫颈癌细胞株。之后对各组细胞连续6天计数，记录其生长情况，发现KAT6B敲减、敲除的细胞增殖速度减慢，并且从计数第4天开始，细胞增殖明显抑制。细胞克隆实验、EdU实验也同样发现，下调KAT6B后细胞增殖明显抑制。而KAT6B过表达则明显促进宫颈癌细胞生长、增殖。在划痕实验、transwell及Matrigeltranswell实验发现，抑制KAT6B后，细胞迁移、侵袭较对照组明显抑制，而KAT6B过表达组均出现促进迁移、侵袭的结果。
3.KAT6B增加S期阻滞。KAT6B-siRNA、KAT6B-CRISPR/Cas9-KO细胞株G0-1期、G2-M期细胞数量明显减少，而S期细胞明显增加，出现S期阻滞的情况。而KAT6B过表达的细胞株则出现相反的结果，S期细胞减少，反而G2-M期细胞比例明显增加，有促进细胞周期进程的作用。
4.KAT6B抑制AMPKα信号通路，减少对mTORC1的抑制作用，并且促进生长因子受体EGFR、PDGFRα、PDGFRβ的激活。westernblot结果表明，KAT6B下调的宫颈癌细胞株中KAT6B表达减少，磷酸化的AMPKα表达增加，并且，磷酸化的mTOR、AKT、S6表达情况与KAT6B一致，均为表达减少。检测相关生长因子受体EGFR、PDGFRα、PDGFRβ等也发现一致性的表达减少。而KAT6B过表达的细胞中则出现相反的结果。
5.KAT6B高表达是宫颈癌的不良预后因素。在两种组织细胞浆、细胞核中均检测到KAT6B表达。其中宫颈癌KAT6B高表达为30.43％(胞浆)、33.91％(胞核)，差异无统计学意义。正常宫颈KAT6B高表达占2.94％(胞浆)、23.53％(胞核)，差异有统计学意义。运用Kaplan-Meier方法分析发现KAT6B高表达(胞浆/胞核)的宫颈癌患者总生存期(Overall Survival，OS)、无病生存期(Progression Free Survival，PFS)更短。单因素及COX回归方法分析KAT6B表达、肿瘤组织类型、分级、FIGO分期与预后等临床指标的相关性，发现FIGO分期、胞浆及胞核中高KAT6B表达是影响OS的独立预后因素(FIGO分期:HR3.531，95％CI1.763-7.071，p＜0.05;胞浆:HR2.949,95％CI1.443-6.025,p＜0.05;胞核:HR2.529,95％CI1.248-5.128,p＜0.05),亦是影响PFS的独立预后因素(FIGO分期:HR3.531，95％CI1.763-7.071，p＜0.05;胞浆:HR2.968，95％CI1.541-5.713，p＜0.05;胞核:HR2.529，95％CI1.321-4.816，p＜0.05)。
结论
1.宫颈癌组织中KAT6B表达增加，EGFR、PDGFRα蛋白也相应的表达增加，而AMPKα的表达则与周围正常组织相比无明显差异，KAT6B可能是促进宫颈癌增殖的因素之一。
2.KAT6B敲减与敲除的宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力均明显下降，而KAT6B过表达的宫颈癌细胞则表现出相反的结果。KAT6B在宫颈癌增殖、迁移、侵袭中具有重要作用。
3.结合本课题组既往研究，本文中结果表明宫颈癌中KAT6B诱导了AMPKα激活抑制，并促进多种酪氨酸激酶受体的激活，引起下游AKT-mTOR信号通路的激活，这可能是KAT6B促进宫颈癌增殖的信号机制。
4.宫颈癌组织中KAT6B表达增加，且胞浆与胞核中表达无明显差异。宫颈癌中KAT6B表达与年龄、FIGO分期、淋巴结相关，与病理类型、肿瘤分级无关。KAT6B高表达患者预后较差，OS及PFS更低。FIGO分期、KAT6B表达为OS、PFS的独立预后因素。
宫颈癌居我国妇科肿瘤发病第一位、死亡第一位。目前认为，一系列的促癌基因(oncogenes)过度表达和活化是宫颈癌发生、发展的主要原因。赖氨酸乙酰转移酶(lysine acetyltransferases，KATs)具有组蛋白乙酰化作用，对染色体的结构和功能至关重要。在编码KATs的基因中，KAT6B是一个非常重要的肿瘤驱动基因，其扩增在多种肿瘤中发现，比如宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肠癌等。越来越多的研究发现，宫颈癌中磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)低表达者预后更差。但是，KAT6B、AMPK信号通路在宫颈癌发展中的作用尚未明确。
本项目拟运用分子、细胞生物学等方法，研究KAT6B在宫颈癌发展中的作用及KAT6B-AMPKα在宫颈癌发展中相关信号机制。进一步研究KAT6B在宫颈癌患者中表达及对临床预后的影响。探讨宫颈癌治疗新的潜在靶点(KAT6B-AMPKα)。
研究方法及材料
首先，收集江苏大学附属昆山医院手术切除的未做任何放疗、化疗的新鲜原发宫颈癌标本6例，PCR检测组织中KAT6B表达情况，并运用westernblot方法检测宫颈癌组织中KAT6B、AMPKα表达情况。
随后，从上海生命科学研究院购买人宫颈癌Hela、C33a细胞株，分别转染siRNA、CRISPR/Cas9-KO及过表达(over expression)KAT6B病毒，建立不同KAT6B表达、稳转的宫颈癌细胞株。采用显微镜下每日记录细胞数量、克隆形成实验以研究各组细胞生长情况;运用EdU方法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞周期;运用细胞划痕实验、transwell实验研究各组细胞迁移，Matrigeltranswell实验检测细胞侵袭。Westernblot检测KAT6B、AMPKα和磷酸化的AMPKα、磷酸化的AKT及mTOR、S6和磷酸化的S6，并检测相关生长因子受体EGFR、PDGFRα、PDGFRβ等信号通路的改变。
最后，收集江苏大学附属昆山医院活检及手术切除的未做任何放疗、化疗的宫颈癌标本(新鲜及石蜡包埋)119例，取手术周边正常组织(35例)作为对照，运用免疫组化方法检测宫颈癌组织及正常宫颈组织中KAT6B表达，并分析其与宫颈癌病理类型、分期、分级、预后等临床指标的相关性。进一步研究KAT6B在宫颈癌发展中的作用。
细胞种板的数量、试剂的浓度及具体实验方法基于发表文献和预实验的结果。
统计学处理
在每次细胞学实验中，至少设置3个副孔，并且每个实验至少重复3次。使用SPSS22.0及GraphPadprism7.0软件进行分析统计及作图，并运用one-wayANOVA，Scheffe和Tukey检验、Chi-square检验、Kaplan-Meier法和COX回归分析等方法分析实验数据。P＜0.05被认为有统计学意义。
研究结果
1.宫颈癌组织中KAT6B相比正常宫颈组织表达增加。收集江苏大学附属昆山医院手术切除的未做任何放疗、化疗的新鲜原发宫颈癌标本6例，PCR检测组织中KAT6BmRNA水平，结果发现宫颈癌组织中的mRNA水平较周围正常组织明显增加。进一步运用westernblot方法检测宫颈癌组织及正常组织中KAT6B及AMPKα蛋白表达水平，发现宫颈癌组织中KAT6B、EGFR、PDGFRα蛋白表达明显增加。AMPKα则较正常组织相比减少，但无统计学意义。
2.KAT6B促进宫颈癌细胞生长、增殖、迁移、侵袭。建立不同KAT6B表达、稳转的宫颈癌细胞株。之后对各组细胞连续6天计数，记录其生长情况，发现KAT6B敲减、敲除的细胞增殖速度减慢，并且从计数第4天开始，细胞增殖明显抑制。细胞克隆实验、EdU实验也同样发现，下调KAT6B后细胞增殖明显抑制。而KAT6B过表达则明显促进宫颈癌细胞生长、增殖。在划痕实验、transwell及Matrigeltranswell实验发现，抑制KAT6B后，细胞迁移、侵袭较对照组明显抑制，而KAT6B过表达组均出现促进迁移、侵袭的结果。
3.KAT6B增加S期阻滞。KAT6B-siRNA、KAT6B-CRISPR/Cas9-KO细胞株G0-1期、G2-M期细胞数量明显减少，而S期细胞明显增加，出现S期阻滞的情况。而KAT6B过表达的细胞株则出现相反的结果，S期细胞减少，反而G2-M期细胞比例明显增加，有促进细胞周期进程的作用。
4.KAT6B抑制AMPKα信号通路，减少对mTORC1的抑制作用，并且促进生长因子受体EGFR、PDGFRα、PDGFRβ的激活。westernblot结果表明，KAT6B下调的宫颈癌细胞株中KAT6B表达减少，磷酸化的AMPKα表达增加，并且，磷酸化的mTOR、AKT、S6表达情况与KAT6B一致，均为表达减少。检测相关生长因子受体EGFR、PDGFRα、PDGFRβ等也发现一致性的表达减少。而KAT6B过表达的细胞中则出现相反的结果。
5.KAT6B高表达是宫颈癌的不良预后因素。在两种组织细胞浆、细胞核中均检测到KAT6B表达。其中宫颈癌KAT6B高表达为30.43％(胞浆)、33.91％(胞核)，差异无统计学意义。正常宫颈KAT6B高表达占2.94％(胞浆)、23.53％(胞核)，差异有统计学意义。运用Kaplan-Meier方法分析发现KAT6B高表达(胞浆/胞核)的宫颈癌患者总生存期(Overall Survival，OS)、无病生存期(Progression Free Survival，PFS)更短。单因素及COX回归方法分析KAT6B表达、肿瘤组织类型、分级、FIGO分期与预后等临床指标的相关性，发现FIGO分期、胞浆及胞核中高KAT6B表达是影响OS的独立预后因素(FIGO分期:HR3.531，95％CI1.763-7.071，p＜0.05;胞浆:HR2.949,95％CI1.443-6.025,p＜0.05;胞核:HR2.529,95％CI1.248-5.128,p＜0.05),亦是影响PFS的独立预后因素(FIGO分期:HR3.531，95％CI1.763-7.071，p＜0.05;胞浆:HR2.968，95％CI1.541-5.713，p＜0.05;胞核:HR2.529，95％CI1.321-4.816，p＜0.05)。
结论
1.宫颈癌组织中KAT6B表达增加，EGFR、PDGFRα蛋白也相应的表达增加，而AMPKα的表达则与周围正常组织相比无明显差异，KAT6B可能是促进宫颈癌增殖的因素之一。
2.KAT6B敲减与敲除的宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力均明显下降，而KAT6B过表达的宫颈癌细胞则表现出相反的结果。KAT6B在宫颈癌增殖、迁移、侵袭中具有重要作用。
3.结合本课题组既往研究，本文中结果表明宫颈癌中KAT6B诱导了AMPKα激活抑制，并促进多种酪氨酸激酶受体的激活，引起下游AKT-mTOR信号通路的激活，这可能是KAT6B促进宫颈癌增殖的信号机制。
4.宫颈癌组织中KAT6B表达增加，且胞浆与胞核中表达无明显差异。宫颈癌中KAT6B表达与年龄、FIGO分期、淋巴结相关，与病理类型、肿瘤分级无关。KAT6B高表达患者预后较差，OS及PFS更低。FIGO分期、KAT6B表达为OS、PFS的独立预后因素。