牛血清白蛋白定量检测酶联免疫方法的建立

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本试验的目的是制备抗牛血清白蛋白多克隆抗体,筛选高效抗牛血清白蛋白的单克隆抗体细胞株,并采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA),建立牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)的定量检测方法。   以新西兰大白兔作为免疫动物制备抗BSA多克隆抗体;然后采用杂交瘤技术,筛选抗BSA单克隆抗体细胞株,并以间接酶联免疫法(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测单克隆抗体的抗体滴度。获得的单抗分别采用辛酸.硫酸铵法与葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A,SPA)亲和层析法纯化并比较两种方法的纯化纯度,确定纯化方法;然后通过特异性实验,筛选高度特异的单克隆抗体。以纯化后的抗BSA单克隆抗体包被抗体,辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体作为酶标抗体,采用双抗体夹心ELISA法,绘制定量标准曲线,建立BSA检测方法,并对该方法进行验证。   实验成功获得抗牛血清白蛋白多克隆抗体;成功筛选4株抗牛血清白蛋白单克隆抗体及稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体滴度均可达到106或以上,最终从中筛选出可用于BSA抗原定量检测的单克隆抗体;成功建立此方法,其最佳线性范围为1.25-20ng/ml,线性关系良好,r>0.99;定量限度为1.25ng/ml;准确性试验回收率为90-106%;精密性变异系数分别为3.3~5.1%;与豚鼠血清、兔血清、卵清蛋白、小鼠血清、人血清白蛋白、公鸡血清及Casein均无交叉反应,具有良好的特异性。   本研究初步建立疫苗中残余牛血清白蛋白双抗体夹心ELISA定量检测方法。该方法特异性强,灵敏度高,准确性、重复性和稳定性好,适用于检测疫苗制品中的残余牛血清白蛋白含量。
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