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植物内生真菌作为真菌类群中的一部分,是一个非常庞大的群体,由于其生境独特,很可能产生一些化学结构新颖,活性多样的次级代谢产物。近年来植物内生真菌已经成为研究活性天然产物的重要资源。
藜芦(Veratrum nigrum Linn)系百合科多年生草本植物,《中药大词典》称“藜芦可用于治疗中风失语、黄疸、疥疮”等。现代中医中药研究,证明藜芦植物中所含的生物碱和藜芦胺单体均具有明显的降压和减慢心率作用。本论文选择藜芦植物为研究材料,以不同季节对其根、茎、叶等不同组织开展了藜芦植物内生真菌的分离、鉴定,以及种类组成分析和种群分布情况,共分离获得藜芦植物内生真菌290株。经鉴定划分为5目、8科、39属。优势种群为无孢目,占总数的33.4%;优势属为毛霉属和镰孢属,分别是14.1%和13.1%。其中,冬季分离获得藜芦植物内生真菌共17株,占分离菌株总数的5.9%,鉴定为3目,3科,6属,以镰孢属Fusarium.为优势种群;夏季分离获得藜芦植物内生真菌共151株,占分离菌株总数的52.1%,划分为4目,6科,22属,以无孢类群Mycelia sterilia和毛霉属Mucor为优势种群;秋季分离获得藜芦植物内生真菌共122株,占分离菌株总数的42.1%,归纳为5目,7科,29属,以刺盘孢菌属Colletotrichum,无孢菌群Mycelia sterilia,镰孢属Fusarium和交链孢属Alternaria为优势种群。研究表明藜芦植物在不同的时节其内生真菌在种群数量、种类组成、以及种群分布方面都存在着较大差异。
对上述所分离得到的290株内生真菌进行抗菌活性研究,结果表明藜芦植物内生真菌中广泛分布着抗菌活性菌株(占总菌株的19.7%)。其中筛选到一株菌株编号为Ym312548(曲霉属Aspergillus)的内生真菌,该菌株发酵产物具有较广的抑菌谱,分别对藤黄八叠球菌(Sarcina lutea),犬小孢子菌(Microsporum canis)和玉蜀黍长蠕孢(Helminthosporium maydis)等为代表的9种病原微生物具有抑制生长作用,最大抑菌圈直径可达到17mm,而且抗菌活性比较稳定,这对寻找新型抗菌药物方面具有一定的指导意义。另外采用TLC和生物碱显色方法,对所分离得到的藜芦内生真菌进行产生物碱活性筛选,观察到菌株Ym312628(镰孢属Fusarium)具有显著的生物碱显色阳性反应。
同时,本文还对所筛选到的藜芦植物内生真菌Ym312548(曲霉属Aspergillus)和Ym312628(镰孢属Fusarium)菌株进行了系统的分类学研究。根据菌株形态特征,结合ITS和18SrDNA序列分析,确定菌株Ym312548和Ym312628分别为鹿皮色曲霉(Aspergillus cervinus)和燕麦镰刀菌(Gibberella avenacea),均属藜芦植物内生真菌首次报道。
另外,选择产生物碱活性菌株Ym312628(燕麦镰刀菌Gibberella avenacea)开展了次生代谢产物的化学成分研究。在对该菌株发酵条件的初步研究,制定出适合的发酵培养基及发酵条件基础上,并对其代谢产物进行了分离,得到7个化合物,其中三个化合物结构鉴定分别为3-苯基乳酸、5-丁基吡啶甲酸、啤酒甾醇,还有一个麦角甾醇类物质具体结构还需进一步鉴定:以及三个生物碱阳性反应物质初步判断为一类带有核苷酸单元的化合物结构类似物,但具体化学结构还需进一步分析鉴定。据文献报道化合物3-苯基乳酸(丹参素的衍生物)与丹参素的药理作用相同,因此本研究对生产丹参素的替代品-3-苯基乳酸提供了有效的途径。