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目的
镍化合物和反式-BPDE是环境污染物和致癌物，但其致癌的机制仍不是很清楚。在多阶段癌变过程中，DNA甲基化异常可能是引起原癌基因激活和抑癌基因灭活的又一种机制。DNA修复系统在面临复制错误和环境危害的累积效应时发挥作用，以维持基因组的稳定性和完整性。DNA错配修复(MMR)是DNA修复的主要途径之一。错配修复基因是生物进化过程中的保守基因，具有修复DNA碱基错配、增强DNA复制忠实性、维持基因组稳定性和降低自发性突变的功能。hMSH2是一种重要的DNA错配修复基因，其启动子甲基化影响hMSH2修复功能的正常发挥，使癌相关基因的突变不能及时有效纠正，最终导致肿瘤发生。为了深入研究DNA错配修复基因hMSH2的甲基化在镍化合物和反式-BPDE致癌过程中的作用机制，该课题运用分子生物学的各种手段检测了结晶型NiS和反式-BPDE恶性转化及裸鼠接种成瘤的人支气管上皮细胞系16HBEhMSH2基因启动子甲基化的变化、mRNA和蛋白的表达差异，并初步进行了甲基化状态的逆转处理，为筛选接触镍及B(a)P的高危人群、建立早期的肿瘤生物监测指标提供有力的工具，并对今后研究开发预防及治疗肿瘤的去甲基化药物和癌细胞的逆转提供一定线索。
方法
1、对非转化人支气管上皮细胞系16HBE、结晶型NiS恶性转化及其接种裸鼠成瘤的16HBE、反式-BPDE恶性转化及其接种裸鼠成瘤的16HBE、大细胞肺癌细胞株NCIH460进行基因组DNA的抽提，采用甲基化特异性PCR(MSP)法检测hMSH2基因启动子甲基化的变化。
2、通过对非转化人支气管上皮细胞系16HBE、结晶型NiS恶性转化及其接种裸鼠成瘤的16HBE、反式-BPDE恶性转化及其接种裸鼠成瘤的16HBE、NCIH460总RNA的抽提、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法，以β-Actin作为内参对照，半定量检测hMSH2基因mRNA表达水平；并采用SYBR(R)GreenⅠ荧光定量PCR(FQ-PCR)方法，进一步相对准确地测定了上述细胞中hMSH2基因mRNA的表达差异。
3、对非转化人支气管上皮细胞系16HBE、结晶型NiS恶性转化及其接种裸鼠成瘤的16HBE、反式-BPDE恶性转化及其接种裸鼠成瘤的16HBE进行总蛋白的抽提，以α-tubulin作为内参对照，用蛋白免疫印迹法(Westernblot)鉴定上述细胞中hMSH2的蛋白表达差异。
4、将结晶型NiS恶性转化及其接种裸鼠成瘤的16HBE、反式-BPDE恶性转化及其接种裸鼠成瘤的16HBE、NCIH460分别用去甲基化因子5-脱氧杂氮胞苷(5-Azac)处理后，重新检测hMSH2启动子甲基化的情况。
结果
1、hMSH2基因启动子甲基化状态用hMSH2甲基化引物扩增经亚硫酸氢盐化学修饰的模板，结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化和成瘤的16HBE细胞以及阳性对照大细胞肺癌NCIH460均有甲基化等位基因的扩增，而正常对照16HBE细胞则为阴性；用hMSH2未甲基化引物扩增经化学修饰的模板，正常对照16HBE细胞有非甲基化等位基因的扩增，同时结晶型NiS和反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞以及NCIH460也出现了非甲基化的条带。
2、hMSH2基因mRNA表达情况抽提待检细胞总RNA，经两步法RT-PCR扩增后，获得429bp的hMSH2cDNA的目的片段。用琼脂糖凝胶电泳鉴定RT-PCR产物，并用凝胶成像系统扫描hMSH2和β-Actin电泳条带，结果显示与非转化16HBE细胞相比，结晶型NiS恶性转化及其接种裸鼠成瘤的16HBE、反式-BPDE恶性转化及其接种裸鼠成瘤的16HBE、NCIH460的hMSH2基因mRNA表达水平均有不同程度的降低。
逆转录合成cDNA后，采用SYBR(R)GreenⅠ荧光染料法，在ABI7000全自动荧光定量PCR仪上进行扩增，根据相对定量的△△CT法，以GAPDH作为内对照，得出每个样品中hMSH2基因的平均相对含量，结果发现NiS和反式-BPDE恶性转化及成瘤细胞以及NCIH460中hMSH2基因的平均相对含量与对照组16HBE比较有明显降低。
3、hMSH2基因蛋白表达情况抽提待检细胞总蛋白后，以α-tubulin作为内参对照，用蛋白免疫印迹法检测各细胞中hMSH2的蛋白表达水平。用全自动图像分析系统对蛋白印迹胶片进行半定量分析，结果证实NiS及反式-BPDE恶性转化和其接种裸鼠成瘤的16HBE细胞与非转化16HBE细胞相比，hMSH2蛋白的表达均有不同程度的降低。
4、hMSH2基因去甲基化处理用去甲基化因子5-Azac处理原来启动子区存在高甲基化的NiS及反式-BPDE恶性转化和其接种裸鼠成瘤的16HBE细胞以及NCIH460细胞后，再次用MSP方法检测上述5种细胞hMSH2基因启动子区CpG岛的甲基化状态，结果显示用hMSH2未甲基化引物扩增经化学修饰的模板，检测细胞均出现了未甲基化的目的条带；用甲基化引物扩增经化学修饰的模板，原来启动子区存在异常高甲基化的NiS和反式-BPDE恶性转化及其接种裸鼠成瘤的16HBE以及NCIH460均为阴性。
结论
1、结晶型NiS恶性转化细胞和反式-BPDE恶性转化细胞及其接种裸鼠成瘤的人支气管上皮细胞hMSH2基因启动子区存在CpG岛高甲基化现象。
2、hMSH2基因启动子区的甲基化与基因表达水平呈负相关关系，hMSH2基因启动子区高甲基化是基因表达下降的重要原因。
3、结晶型NiS恶性转化细胞和反式-BPDE恶性转化细胞及其接种裸鼠成瘤的人支气管上皮细胞hMSH2基因启动子区的高甲基化造成错配修复酶不能正常行使其修复功能，提示hMSH2基因启动子区甲基化水平的改变可能是镍化合物及反式-BPDE的致癌机制之一。
4、原来存在hMSH2基因启动子区高甲基化的细胞经过去甲基化处理后又恢复了正常的未甲基化状态，初步证实了甲基化的可逆性。