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目的:动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)是心脑血管疾病的主要病理基础,其发病机制尚不明确。目前,炎症损伤反应学说得到公认。大量的研究证实AS是一种发生在大血管和中血管的慢性特异性炎症反应,巨噬细胞源性泡沫细胞是动脉粥样硬化炎症反应的特征性病理细胞,在巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞并堆积成AS斑块的同时,单核/巨噬细胞源性泡沫细胞还分泌大量的炎症因子,多种炎症介质的参与不仅促进了AS病变的形成和发展,而且可引发急性冠状动脉综合症等临床症状。因此,抗炎干预已成为防治AS的新方向。
七叶皂苷钠(sodium aescinate)是采用先进工艺从七叶树科植物天师栗(WilsonBuckeye Seed)的干燥成熟果实娑罗子中提取得到的三萜皂苷钠盐。临床主要用于治疗脑水肿以及创伤引起的肢体炎症肿胀。近年来的研究显示,七叶皂苷具有显著的抗炎、清除氧自由基、抑制血管新生等作用,提示对动脉粥样硬化性疾病可能有潜在的治疗价值。本研究采用人类单核/巨噬细胞系U937细胞通过ox-LDL诱导转化为单核/巨噬细胞源性泡沫细胞,研究七叶皂苷钠对单核/巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响以及对一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和抵抗素分泌的影响,探讨七叶皂苷钠在与动脉粥样硬化密切相关的炎症反应过程中的作用,为开发其新的临床用途提供理论和实验依据。
方法:无菌条件下将U937细胞复苏及传代培养,将同一代细胞分为调零组、正常对照组及七叶皂苷钠5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml组,饱和湿度条件下培养48h,MTT法测定各组细胞存活率,根据实验结果确定后续实验所用药物浓度。
1.七叶皂苷钠对ox-LDL诱导的泡沫细胞形成的影响将U937细胞分正常对照组、ox-LDL组(在正常培养液中加入80mg/L的ox-LDL)、七叶皂苷钠5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml组(在分别加入不同浓度的七叶皂苷钠的同时加入80mg/L的ox-LDL)。各组细胞在培养48h后离心,收集细胞,油红O染色,在光镜下进行细胞形态学观察。
2.七叶皂苷钠对ox-LDL诱导U937细胞分泌炎症因子的影响
(1)确定ox-LDL诱导U937单核细胞分泌炎症因子的最适剂量及最佳时间:取同一代U937细胞,将其与不同浓度的ox-LDL(0,20,40,80mg/L)共同培养24h,分别测定细胞上清液中NO、IL-6和TNF-α的含量；然后选取刺激U937细胞分泌炎症因子的最佳ox-LDL浓度(40mg/L),在孵育不同时间(0,12,24,48h)后分别测定细胞上清液中NO、IL-6和TNF-α的含量。
(2)观察七叶皂苷钠对ox-LDL诱导U937细胞分泌炎症因子的影响:将U937细胞分为正常对照组、ox-LDL组(40mg/L)、七叶皂苷钠5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml组。培养24h后离心,收集上清液用于检测NO、TNF-α、IL-6、MCP-1和抵抗素的含量。
NO含量采用硝酸还原酶法检测,酶联免疫吸附(ELISA)试验测定TNF-α、IL-6、MCP-1和抵抗素的蛋白表达。
结果:ox-LDL与U937细胞共同孵育48h后,光镜下可见细胞体积增大,胞浆内出现明显的红染颗粒,提示细胞内脂质成分增加,符合泡沫细胞的形态特征。而同时加入20μg/ml和10μg/ml七叶皂苷钠的细胞未出现上述改变,其形态特征与正常U937细胞近似。
本实验发现40mg/L和80mg/L的ox-LDL均可诱导U937细胞分泌NO、IL-6和TNF-α增加(P<0.01),以40mg/L的作用最为明显；U937细胞与40mg/L的ox-LDL共同孵育12h,NO的分泌即达到高峰,而IL-6和TNF-α则分别在24h、48h分泌量达高峰。综合分析后选用40mg/L的ox-LDL与U937细胞共同孵育24h,刺激U937细胞分泌炎症因子,并观察七叶皂苷钠的影响。
与对照组U937细胞相比较,40mg/L的ox-LDL可显著增加细胞分泌NO(P<0.05)并提高TNF-α、IL-6、MCP-1和抵抗素的蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01)。10μg/ml和20μg/ml的七叶皂苷钠能够明显降低ox-LDL诱导的上述炎症因子的升高(P＜0.05或P<0.01)。
结论:七叶皂苷钠能够抑制ox-LDL诱导的U937单核/巨噬细胞源性泡沫细胞的形成,并且显著降低ox-LDL诱导的LJ937细胞分泌NO、TNF-α、IL-6、MCP-1和抵抗素等炎症因子,对动脉粥样硬化会产生有益的影响。