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目的：⑴研究人羊膜上皮细胞(hAECs)体外培养的生物学特性，探讨hAECs体外培养的方法及其干细胞特性，为基因转染hAECs并进行角膜表层重建奠定实验基础。⑵利用慢病毒载体构建携带有目的基因人端粒酶催化亚基(hTERT)和标记基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体pLenti6/V5—DEST—hTERT—EGFP，为基因转染hAECs奠定实验基础。⑶利用慢病毒将目的基因人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)和标记基因EGFP转染入人羊膜上皮细胞(hAECs)，并扩增培养含hTERT—EGFP基因的克隆细胞，⑷利用荧光定量PCR和Western blot方法从mRNA和蛋白质水平检测hTERT基因在转基因hAECs中的表达。⑸研究转基因人羊膜上皮细胞(hAECs)在新鲜角膜基质片上的生存情况，为基因转染hAECs并进行角膜表层重建奠定实验基础。
方法：①采用酶消化法体外分离培养hAECs，观察细胞在体外培养条件下的生长情况，并对生长良好的原代细胞进行消化传代，在光镜下对细胞进行形态学观察和HE染色观察。以PCI—neo—hTERT质粒为模板PCR法获取目的基因hTERT，通过BP反应，将hTERT定向克隆至pDONR221得pDONR221—hTERT；以质粒pEGFP—N1为模板，通过PCR反应得到—linker—EGFP—产物。②通过双酶切，T4—DNA连接酶反应，得到pDONR221—hTERT—EGFP产物。然后转化大肠杆菌DH5α，卡那霉素筛选，挑克隆行PCR、酶切及测序鉴定。③细胞终止转染后，继续培养24 h，加入含杀稻瘟菌素终浓度为1ug/ml的完全培养基，对细胞进行加压筛选，筛选10天左右，直至单个细胞克隆形成。④应用荧光定量PCR(Real Time-PCR)方法检测hTERT mRNA在转染细胞中的表达。⑤新鲜角膜基质片上的细胞培养3天后和利用气液界面培养10天后，固定、脱水、包埋、切片，进行HE染色后光学显微镜观察。
结果：⑴在体外培养条件下，hAECs能贴壁生长，细胞呈典型的上皮细胞样外观，正常情况下可传7—8代。HE染色可见细胞大小较均一，呈不规则的多角形，细胞连接成片。⑵成功扩增出长达约3.4Kbp的attB1—hTERT—attB2片段，行PCR、酶切及测序鉴定，证实hTERT已克隆入入门载体pDONR221，并成功获得pDONR221—hTERT—EGFP产物。⑶培养的人羊膜上皮细胞加入转染液12h后，有少数细胞从培养板上脱落下来漂浮于培养液中，大多数转染细胞筛选出的抗性克隆以及培养的克隆细胞均与正常细胞在形态上无显著差异。⑷裸鼠在屏障环境下饲养一周后，接种HepG2肝癌细胞的裸鼠注射部位即有肿瘤长出，并随着饲养天数的延长逐渐长大，而接种转基因hAECs的裸鼠注射部位无明显变化。⑸制备角膜缘干细胞缺乏模型术后观察，两个月后有10只兔眼表现为角膜表面结膜化，新生血管膜形成，全角膜灰白色混浊。另2只兔眼角膜没有出现明显的结膜化，但已长出大量新生血管，并逐渐向角膜中间蔓延。
结论：①通过酶分离法可成功分离出纯度较高的hAECs，获得的细胞能在体外进行短期内培养。②成功构建慢病毒重组质粒pLenti6/V5—DEST—hTERT—EGFP。③证明目的基因人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)和标记基因EGFP经慢病毒介导转染入人羊膜上皮细胞(hAECs)后，并可在细胞内获得瞬时表达和稳定表达，且瞬时转染48h，人羊膜上皮细胞(hAECs) EGFP阳性表达率最高，为18.53％。④从mRNA水平检测到hTERT基因在体外培养的hAECs中成功转染和表达，但蛋白质水平上没有检测到转染细胞中hTERT蛋白的表达，说明hTERT基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达并不平衡。⑤新鲜角膜基质有利于人羊膜上皮细胞形成类似角膜上皮的复层排列，且表达角膜上皮细胞特异性抗体CK12。⑥转基因pLenti6/V5—DEST—hTERT—EGFP人羊膜上皮细胞可以成为重建角膜表层的一种新的种子细胞。