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背景：
在整体人群中，乳腺癌是全球发病率第二的恶性肿瘤，占癌症总发病人口的11.6%，排在肺癌之后。在全球女性中，乳腺恶性肿瘤是最常见的恶性肿瘤疾病，同时也是恶性肿瘤致死的主要原因。最新癌症报告显示，2018年全世界将有大约210万新诊断的女性乳腺癌病例，占女性癌症病例的近四分之一。我国东部和中部地区妇女的乳腺癌发病率第一。远处转移是恶性肿瘤患者的主要死因，而肿瘤转移是一个复杂的、多步骤、多因素的过程。近年研究发现的长链非编码RNA可能在恶性肿瘤的发生、发展中起到重要作用。
长链非编码RNA（longnon-codingRNA,lncRNA）是一类由RNA聚合酶II转录形成，转录?长度超过200nt的RNA分子，通常具有polyA尾，广泛分布于各种生物体内。虽然已经发现几个lncRNAs可以编码具有生物学意义的功能的肽，但是普遍认为它不编码大分子蛋白。并且它可在表观遗传学，转录水平和转录后水平等多个层面调控调控胚胎发育、分化、细胞增殖和转移等各种生命活动：①lncRNAs可以通过招募染色质重构复合体到特定位点进而控制细胞的表观遗传状态和相关基因的表达；②lncRNAs可以和一些基因的转录因子相结合，控制基因转录；③与小的调节性RNA类似，lncRNAs可以和某些蛋白编码基因的mRNA形成互补双链，掩盖了mRNA中结合反式作用因子所需的关键元素，影响转录后的基因表达的任何步骤；④直接和特定蛋白质结合，lncRNAs的转录?能够调控特定蛋白的生物学活性，或者lncRNAs与蛋白质共同参与形成RNA-蛋白质复合体，或者改变某些蛋白在细胞内的定位；⑤LncRNA可以作为竞争性内源RNA(competitiveendogenousRNA)发挥“海绵效应”与miRNA结合，从而调控它们对mRNA的直接作用。这些数据都证实了lncRNA对于基因表达的调控起着至关重要的作用，它参与了恶性肿瘤发生发展的过程，在恶性肿瘤的不同发展阶段都发挥重要的作用。
目的：
1.研究lncRNA在乳腺癌中的调控作用，从乳腺癌患者癌组织和癌旁正常组织的长链非编码RNA差异谱芯片入手，用临床乳腺样?验证，筛选出表达量有差异的lncRNA。
2.筛选出lncRNA后进行初步分析，根据lncrna的特点确定下一步研究路线。
3.构建稳定过表达lncRNA的细胞系，研究其对乳腺癌细侵袭转移的调控作用。
4.在动物体内验证lncRNA对乳腺癌细胞转移的调控作用。
5.探索lncRNA参与调控乳腺癌细胞转移的分子机制。
方法：
1.采集了3例经病理确诊的乳腺癌患者的癌组织和癌旁正常组织，使用安捷伦科技公司提供的高通量lncRNA基因芯片，生成乳腺癌癌灶组织与正常组织中lncRNA表达谱。
2.设定合适的条件（差异倍数大于10、有统计学意义P＜0.05）,初步筛选lncRNA。
3.用RT-PCR对lncRNA进行验证，结合TCGA数据库分析表达量差异与临床病理特征的相关性。使用荧光原位杂交确定lncRNA的细胞内分布。
4.根据lncRNA自身特性在乳腺癌细胞系中选取合适的细胞株，构建过表达lncRNA的质粒，使用逆转录病毒包被过表达质粒，感染乳腺癌细胞株，筛选出稳定过表达的细胞。
5．通过迁移侵袭实验进一步研究lncRNA对乳腺癌细胞转移的影响，然后以NOD/SCID小鼠为模型，尾静脉注射稳定过表达lncRNA的乳腺癌细胞，活体成像观察乳腺癌细胞的肺转移情况。
6.相对和绝对定量同位素标记(IsobarictagsforrelativeandabsoluteQuantification，iTRAQ)技术与多维液相色谱联用，分析过稳定过表达ENST00000449361的细胞株与空白对照组细胞株之间蛋白表达差异，筛选出有意义的蛋白，采用GO和KEGG通路分析，找出目标蛋白进行拯救实验。
结果：
1.在lncRNA表达中谱筛选出了Changefold≥10的差异表达的lncRNA，共有81条，其中表达量上调的有54条，表达量下调的有27条。通过分析80例临床组织样?PCR结果，初步筛选出了一条lncRNA，查询ENSEMBL网站，得知它的名字是ENST00000449361，一共681个碱基，位于chr7:90940682-90965056(+)。
2.80例临床组织样?的RT-PCR结果显示ENST00000449361在乳腺恶性肿瘤组织中的表达要低于相匹配的正常组织，结合TCGA数据库的数据我们得出了相同的结论。荧光原位杂交结果显示ENST00000449361在细胞质内的量比核内要多，提示它可能在胞质内发挥作用。
3.与乳腺正常上皮细胞MCF10A相比，侵袭能力高的细胞株BT474、SKBR3、BT549、MDA-MB-231中ENST00000449361的表达量更低。因此我们选择MDA-MB-231和BT549细胞株去构建模型。
4.ENST00000449361经过PCR扩增后，与pcDNA3.1共同构建过表达质粒，导入逆转录病毒中去感染MDA-MB-231和BT549细胞株，筛选出稳定过表达ENST00000449361的细胞，然后用迁移侵袭实验证明了lcn-ENST00000449361抑制乳腺癌细胞转移的功能；接着以Balb/cnude裸鼠为模型研究ENST00000449361在动物体内对乳腺癌细胞MDA-MB-231肺转移能力的影响。尾静脉注射带有荧光表达质粒的乳腺癌细胞系MDA-MB-231以及对照细胞株,小鼠活体成像系统显示ENST00000449361能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的肺转移。
5.通过分析过稳定过表达ENST00000449361的细胞株与空白对照组细胞株之间的蛋白表达差异，采用GO分析和KEGG信号通路分析软件，发现GSK-3β这个蛋白在稳定过表达细胞中高表达，猜测ENST00000449361可能通过调控GSK-3β这个蛋白来抑制乳腺癌细胞转移。
6.使用GSK-3β的特异性抑制剂HY‐12292来减少GSK-3β的表达，进行拯救实验。结果显示GSK-3β表达量下降后，ENST00000449361对于乳腺癌细胞转移的抑制作用减弱。
结论：
1.ENST00000449361在乳腺癌组织中呈低表达状态，在细胞内的分布以细胞质为主。
2.体外试验中ENST00000449361可以抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231和BT549的迁移、侵袭能力。
3.体内试验中，肺转移实验表明ENST00000449361可以在抑制乳腺癌细胞的肺转移能力。
4.ENST00000449361通过调控GSK-3β来抑制乳腺癌细胞转移。
5.ENST00000449361是乳腺癌中一条的非编码抑癌基因，其功能机制和分子作用模式有待后续深入研究。
在整体人群中，乳腺癌是全球发病率第二的恶性肿瘤，占癌症总发病人口的11.6%，排在肺癌之后。在全球女性中，乳腺恶性肿瘤是最常见的恶性肿瘤疾病，同时也是恶性肿瘤致死的主要原因。最新癌症报告显示，2018年全世界将有大约210万新诊断的女性乳腺癌病例，占女性癌症病例的近四分之一。我国东部和中部地区妇女的乳腺癌发病率第一。远处转移是恶性肿瘤患者的主要死因，而肿瘤转移是一个复杂的、多步骤、多因素的过程。近年研究发现的长链非编码RNA可能在恶性肿瘤的发生、发展中起到重要作用。
长链非编码RNA（longnon-codingRNA,lncRNA）是一类由RNA聚合酶II转录形成，转录?长度超过200nt的RNA分子，通常具有polyA尾，广泛分布于各种生物体内。虽然已经发现几个lncRNAs可以编码具有生物学意义的功能的肽，但是普遍认为它不编码大分子蛋白。并且它可在表观遗传学，转录水平和转录后水平等多个层面调控调控胚胎发育、分化、细胞增殖和转移等各种生命活动：①lncRNAs可以通过招募染色质重构复合体到特定位点进而控制细胞的表观遗传状态和相关基因的表达；②lncRNAs可以和一些基因的转录因子相结合，控制基因转录；③与小的调节性RNA类似，lncRNAs可以和某些蛋白编码基因的mRNA形成互补双链，掩盖了mRNA中结合反式作用因子所需的关键元素，影响转录后的基因表达的任何步骤；④直接和特定蛋白质结合，lncRNAs的转录?能够调控特定蛋白的生物学活性，或者lncRNAs与蛋白质共同参与形成RNA-蛋白质复合体，或者改变某些蛋白在细胞内的定位；⑤LncRNA可以作为竞争性内源RNA(competitiveendogenousRNA)发挥“海绵效应”与miRNA结合，从而调控它们对mRNA的直接作用。这些数据都证实了lncRNA对于基因表达的调控起着至关重要的作用，它参与了恶性肿瘤发生发展的过程，在恶性肿瘤的不同发展阶段都发挥重要的作用。
目的：
1.研究lncRNA在乳腺癌中的调控作用，从乳腺癌患者癌组织和癌旁正常组织的长链非编码RNA差异谱芯片入手，用临床乳腺样?验证，筛选出表达量有差异的lncRNA。
2.筛选出lncRNA后进行初步分析，根据lncrna的特点确定下一步研究路线。
3.构建稳定过表达lncRNA的细胞系，研究其对乳腺癌细侵袭转移的调控作用。
4.在动物体内验证lncRNA对乳腺癌细胞转移的调控作用。
5.探索lncRNA参与调控乳腺癌细胞转移的分子机制。
方法：
1.采集了3例经病理确诊的乳腺癌患者的癌组织和癌旁正常组织，使用安捷伦科技公司提供的高通量lncRNA基因芯片，生成乳腺癌癌灶组织与正常组织中lncRNA表达谱。
2.设定合适的条件（差异倍数大于10、有统计学意义P＜0.05）,初步筛选lncRNA。
3.用RT-PCR对lncRNA进行验证，结合TCGA数据库分析表达量差异与临床病理特征的相关性。使用荧光原位杂交确定lncRNA的细胞内分布。
4.根据lncRNA自身特性在乳腺癌细胞系中选取合适的细胞株，构建过表达lncRNA的质粒，使用逆转录病毒包被过表达质粒，感染乳腺癌细胞株，筛选出稳定过表达的细胞。
5．通过迁移侵袭实验进一步研究lncRNA对乳腺癌细胞转移的影响，然后以NOD/SCID小鼠为模型，尾静脉注射稳定过表达lncRNA的乳腺癌细胞，活体成像观察乳腺癌细胞的肺转移情况。
6.相对和绝对定量同位素标记(IsobarictagsforrelativeandabsoluteQuantification，iTRAQ)技术与多维液相色谱联用，分析过稳定过表达ENST00000449361的细胞株与空白对照组细胞株之间蛋白表达差异，筛选出有意义的蛋白，采用GO和KEGG通路分析，找出目标蛋白进行拯救实验。
结果：
1.在lncRNA表达中谱筛选出了Changefold≥10的差异表达的lncRNA，共有81条，其中表达量上调的有54条，表达量下调的有27条。通过分析80例临床组织样?PCR结果，初步筛选出了一条lncRNA，查询ENSEMBL网站，得知它的名字是ENST00000449361，一共681个碱基，位于chr7:90940682-90965056(+)。
2.80例临床组织样?的RT-PCR结果显示ENST00000449361在乳腺恶性肿瘤组织中的表达要低于相匹配的正常组织，结合TCGA数据库的数据我们得出了相同的结论。荧光原位杂交结果显示ENST00000449361在细胞质内的量比核内要多，提示它可能在胞质内发挥作用。
3.与乳腺正常上皮细胞MCF10A相比，侵袭能力高的细胞株BT474、SKBR3、BT549、MDA-MB-231中ENST00000449361的表达量更低。因此我们选择MDA-MB-231和BT549细胞株去构建模型。
4.ENST00000449361经过PCR扩增后，与pcDNA3.1共同构建过表达质粒，导入逆转录病毒中去感染MDA-MB-231和BT549细胞株，筛选出稳定过表达ENST00000449361的细胞，然后用迁移侵袭实验证明了lcn-ENST00000449361抑制乳腺癌细胞转移的功能；接着以Balb/cnude裸鼠为模型研究ENST00000449361在动物体内对乳腺癌细胞MDA-MB-231肺转移能力的影响。尾静脉注射带有荧光表达质粒的乳腺癌细胞系MDA-MB-231以及对照细胞株,小鼠活体成像系统显示ENST00000449361能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的肺转移。
5.通过分析过稳定过表达ENST00000449361的细胞株与空白对照组细胞株之间的蛋白表达差异，采用GO分析和KEGG信号通路分析软件，发现GSK-3β这个蛋白在稳定过表达细胞中高表达，猜测ENST00000449361可能通过调控GSK-3β这个蛋白来抑制乳腺癌细胞转移。
6.使用GSK-3β的特异性抑制剂HY‐12292来减少GSK-3β的表达，进行拯救实验。结果显示GSK-3β表达量下降后，ENST00000449361对于乳腺癌细胞转移的抑制作用减弱。
结论：
1.ENST00000449361在乳腺癌组织中呈低表达状态，在细胞内的分布以细胞质为主。
2.体外试验中ENST00000449361可以抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231和BT549的迁移、侵袭能力。
3.体内试验中，肺转移实验表明ENST00000449361可以在抑制乳腺癌细胞的肺转移能力。
4.ENST00000449361通过调控GSK-3β来抑制乳腺癌细胞转移。
5.ENST00000449361是乳腺癌中一条的非编码抑癌基因，其功能机制和分子作用模式有待后续深入研究。