论文部分内容阅读
本论文是以南方海水养殖的点带石斑鱼为研究对象,从已构建的LPS刺激诱导的头肾cDNA差减文库中,对脂多糖诱发的点带石斑鱼特异表达的cDNA测序,与GenBank等数据库中已有序列进行比对,运用生物信息学技术对序列进行分析,克隆出热休克蛋白70 (HSP70)、免疫球蛋白重链(IgH)、β-肌动蛋白(β-actin)全长cDNA序列。同时,应用实时定量PCR技术研究了在LPS刺激点带石斑鱼后HSP70和IgH在头肾、心脏、脾脏、肝脏、鳃、肠系膜6个组织前后表达的差异性。此外还克隆出了β-actin基因的全长cDNA序列,研究了其在点带石斑鱼中的特异性表达。在已构建的cDNA差减文库中,随机挑取150个阳性克隆进行测序,其中有113个测序成功,经过比对得到29个非重复的有效EST序列,经过BLAST同源性比对,14个EST序列与NCBI数据库中已知功能蛋白具有较高同源性,其中5个EST序列与免疫防御相关基因同源；其余15个EST序列在数据库中未发现同源序列。应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆出HSP70、IgH、β-actin全长cDNA序列,并对他们进行了全面的生物学信息分析。HSP70全长cDNA序列有2824bp,包含5′端490bp的非编码区、3′端384bp的非编码区及poly(A)、1950bp的开放阅读框(ORF),编码649个氨基酸,分子量(MW)为71.16 KDa,等电点是5.14；经过BLAST分析,发现其核苷酸序列与平鲷(Rhabdosargus sarba)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的同源性分别为92%、91%、86%。IgH全长cDNA有2070bp,包含有5′端108bp的非编码区、3′端207bp的非编码区及poly(A)、1755bp的开放阅读框(ORF),编码584个氨基酸,分子量(MW)为64.91 KDa,等电点是5.30；经过BLAST分析,可知其核苷酸序列与斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)、鳜鱼(Siniperca chuats)、花狼鱼(Anarhichas minor)的同源性分别为95%、80%、79%。β-actin全长cDNA序列有2504bp,包含5′端619bp的非编码区、3′端757bp的非编码区及poly(A)、1128bp的开放阅读框(ORF),编码375个氨基酸,分子量(MW)为41.74 KDa,等电点是5.30；经过BLAST分析,其核苷酸序列与斜带石斑鱼、黑鲷(Acanthopagrus schlegeli)、莫桑比克罗非鱼(Tilapia mossambica)同源性分别为99%、98%、95%。应用Real-time PCR技术,以β-actin和GAPDH作为内参,在LPS刺激点带石斑鱼后,分析HSP70、IgH、β-actin在头肾、鳃、肝脏、心脏、脾脏、肠系膜6个组织中表达差异性：其中,研究HSP70、IgH表达差异时以β-actin为内参,研究β-actin表达差异时以GAPDH为内参。结果表明,HSP70、IgH、β-actin基因在点带石斑鱼鳃、头肾、肝脏、心脏、脾脏、肠系膜6个组织中都有表达,其中HSP70在肝脏中表达量最大,IgH在头肾中表达量最大,β-actin在肝脏中表达量较大。在LPS刺激后能诱使HSP70、IgH表达量的上调,在肝脏组织中,HSP70在8h时表达量达到最大值,随后开始慢慢下降；在头肾组织中,IgH在8h时表达量达到最大值,随后出现下降；此外,β-actin基因的表达在LPS刺激前后同组织间的表达差异不明显,而不同组织间的表达量存在一定的差异。本文对点带石斑鱼免疫相关基因的克隆和组织表达差异性分析进行了初步研究,研究结果为研究点带石板鱼相关免疫基因的作用机理和调控机制奠定了基础,对石斑鱼疾病的免疫防治研究具有良好指导意义。