论文部分内容阅读
溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)属弧菌科(Vibrionaceae)弧菌属(Vibrio)，是一种嗜高温、嗜盐性的革兰氏阴性菌，广泛存在于世界各地海水和海产品中，是引起海水养殖鱼、虾、贝类暴发性疾病的主要病原之一。
表达序列标签(EST)是从cDNA文库中随机挑选单克隆进行末端测序得到的基因部分编码序列，通过与其它生物的EST序列或与已知蛋白质进行比较后可以推测该基因的功能，因此：EST分析是一种快速发现新蛋白的编码序列和发掘功能基因资源的好方法。RD-PCR技术可以针对细菌mRNA poly(A)化位点的高度多态性，使细菌cDNA文库的构建更具目的性，筛选鉴定效率提高。
本实验是以溶藻弧菌作为研究对象，使用EZ spin column total RNA IsolationKit提取总RNA，利用oligo(dT)与poly(A)特异结合的特性，以oligo(dT)-cellulose纯化mRNA，并以oligo(dT)<,18>为引物逆转录合成cDNA，采用RD-PCR技术获得分组PCR产物，并与pMD18 T-vector连接转化，使用M13引物对连接产物进行PCR快速鉴定，挑取阳性克隆进行5’端测序，将所获序列与基因数据库已知序列比较，从而可获得许多有价值的基因，建立独有的基因库。
本实验获得总RNA约400μg，提取出的RNA具备完整性，质量高，是cDNA文库构建的良好材料。利用RD-PCR技术我们成功克隆到了214个基因片段，这说明RD-PCR技术可以很好的用于构建细菌poly(A)化mRNA的限制性cDNA文库。通过对已测序的53个基因片段的分析，共有39个ESTs序列与登录在NCBI非冗余蛋白质数据库中的蛋白质序列存在显著的相似性，占有效EST序列总数的73.58％。其中我们还比对到3个与溶藻弧菌毒力相关的基因序列。他们是：细菌Ⅲ型分泌系统易位蛋白(translocation protein in type Ⅲ secretion)、ATP结合盒(ABC转运蛋白，ABC transporter proteinl)、LysR基因家族，这三个基因序列与溶藻弧菌的致病机理有着紧密的联系。
本实验成功构建了溶藻弧菌的cDNA文库，保存了溶藻弧菌基因资源，而且对于溶藻弧菌中有明确功能的特异基因的克隆、表达以及新基因的克隆与功能研究奠定了物质基础。本文还探讨了限制性显示PCR技术在细菌poly(A)化mRNA的cDNA文库构建中的应用价值，这将为以后我们对细菌分子致病机理的的深入研究提供了一个良好的技术平台。