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肺癌(lung cancer)居于恶性肿瘤首位，在中国其发病率与死亡率都是最高的。肺癌分为非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer)和小细胞肺癌(small-cell lung cancer)，其中非小细胞肺癌占85％。尽管检查和治疗手段的进步，但大部分患者发病时已到晚期，预后较差。非小细胞肺癌的主要治疗手段为手术、化疗和放疗，后两者短期疗效尚可，但各种副作用降低患者生活质量。生物治疗是继手术、化疗、放疗之后肿瘤的第四大治疗手段，是指利用生物制剂，如免疫细胞、核酸、蛋白以及小分子化合物，调节人体的免疫系统或者抑制肿瘤生长。
色素上皮衍生因子PEDF(pigment epithelium derived factor)是具有多种生物学功能的蛋白，具有较强的抗新生血管活性作用，在血管增生性眼病中具有良好的治疗效果。在肿瘤领域，PEDF通过抑制肿瘤血管新生，间接抑制实体肿瘤的生长。此外，PEDF还具有直接抗肿瘤生长的作用，即PEDF抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡或者诱导肿瘤细胞良性分化。因此，PEDF具有抗肿瘤的双重作用，有望成为肿瘤治疗的辅助用药，获得研究者的广泛关注。
寻找高效、特异、稳定的抗肿瘤药物一直为广大学者的目标。PEDF具有强效抑制肿瘤的作用，列为抗肿瘤药物的候选靶标，是众多研究者的研究对象。但是，目前，仅有报道PEDF通过抑制新生血管生成来抑制肺癌生长，并且，PEDF直接抗肿瘤细胞的作用也仅仅在相关特定肿瘤细胞株中证实。PEDF能否直接抑制肺癌细胞的生长，在肺癌肿瘤成长过程中体现其直接抗肿瘤作用值得我们研究。本研究拟探讨PEDF对肺癌的治疗效果和机制：观察PEDF在肺癌细胞A549裸鼠移植瘤的治疗效果，以PEDF诱导肺癌细胞凋亡为切入点探讨PEDF的作用机制，为非小细胞肺癌的治疗提供新药物。本论文主要研究内容和结果如下：
1.PEDF蛋白的表达和纯化将含pET30a(+)/PEDF重组体的BL21(DE3)宿主菌，IPTG低温诱导过夜后，收集细菌。细菌经超声后，离心取上清，通过镍柱亲和层析纯化含有6个His-tag的重组PEDF蛋白，可获得高纯度的可溶性PEDF蛋白。
2.PEDF蛋白抑制肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的生长腹腔注射剂量为25mg/kg的PEDF时，发现PEDF对BALB/c裸鼠肺癌(A549)实体瘤的生长具有显著的抑制作用(*P＜0.05)，抑瘤率为64％。
3.PEDF以剂量依赖性方式抑制低氧状态下培养的肺癌A549细胞生长和促进其凋亡3.1PEDF对低氧条件下培养的肺癌A549细胞的生长抑制作用MTT实验结果显示，PEDF对正常氧状态下培养的A549细胞并不起抑制其生长的作用，但是能剂量依赖方式(320nmol/L～1280nmol/L)特异性地抑制低氧状态下培养的A549细胞的生长。
3.2PEDF促进低氧条件下培养的肺癌A549细胞的凋亡用Hoechst33258染色的方法结果：PBS低氧对照组细胞凋亡率为3.8±1.4％，640nmol/LPEDF处理组细胞凋亡率为12.2±2.3％，1280nmol/LPEDF处理组细胞凋亡率为15.7±1.8％，显著高于PBS对照组(*P＜0.05)。
用AnnexinV和PI双染标记的方法得到的结果：PBS低氧对照组细胞凋亡率为5.38±1.4％，640nmol/LPEDF处理组细胞凋亡率为10.8±2.6％，1280nmol/LPEDF处理组细胞凋亡率为13.3±2.2％，显著高于PBS对照组(*P＜0.05)。
4.PEDF导致A549异位移植瘤组织细胞凋亡组织切片原位末端标记技术(Tunel)原位检测肿瘤组织的细胞凋亡，Tunel结果显示：PBS对照组凋亡阳性率为：3.7±1.8％；PEDF组凋亡阳性率为：24.7±3.1％。
5.PEDF诱导体外培养A549细胞凋亡机制的研究5.1PEDF通过下调细胞GRP78的表达来诱导肺癌A549细胞的凋亡通过Western-blotting，RT-PCR，细胞免疫化学三种实验方法证实了在低氧条件下，PEDF确实下调了A549细胞GRP78的转录及表达。Westernblotting检测发现，在常氧条件下，PEDF不能调节肺癌细胞中GRP78的表达。在缺氧条件下，PEDF以剂量依赖方式下调肺癌细胞中GRP78的表达。免疫组织化学染色和RT-PCR结果显示，在低氧条件下，GRP78上调，而加入PEDF后，GRP78表达下调。
5.2PEDF通过上调FasL的表达激活死亡受体途径从而诱导肺癌A549凋亡PEDF除了通过下调GRP78促进细胞凋亡外，还能通过激活死亡受体途径上调FasL，激活caspase-8来促进细胞凋亡。Westernblotting分析结果显示，不论在正常氧，还是低氧条件下，PEDF都能促进A549细胞FasL的表达。在640nm/LPEDF处理18小时后，与对照组相比，细胞FasL的表达增多，而Fas表达无明显变化。结果显示PEDF处理组中肿瘤组织的FasL表达高于对照组，Fas无明显差别。而caspase-8也因FasL的上调而被激活，Westernblotting分析结果显示，PEDF促进A549细胞caspase8的切割。在640nm/LPEDF处理24小时后，与对照组相比，细胞caspase8的总量明显减少，切割增多。
5.3PEDF在动物种植瘤组织中诱导凋亡的相关机制研究利用Westernblotting的方法来检测肿瘤组织中GRP78和FasL的表达情况。结果显示，与对照组相比，PEDF处理组中肿瘤组织GRP78下调，FasL上调(*p＜0.05，N=4)。
结论及意义：
1.证明了在肺癌裸鼠异位种植瘤模型中，PEDF能抑制肺癌生长。
2.首次证明PEDF基因工程蛋白通过直接诱导肺癌A549细胞凋亡抑制肺癌生长。并且初步阐明了PEDF通过上调FasL-激活死亡受体通路以及下调GRP78减少其在低氧状态下对细胞的保护作用这两种分子机制来诱导A549细胞凋亡。
3.PEDF除了能通过抑制血管增生抑制肺癌生长外，还能直接促进肿瘤细胞凋亡从而抑制肺癌生长。该研究拓宽了PEDF治疗恶性肿瘤的作用机制，也为肺癌等恶性肿瘤的新药开发提供了新的作用靶点。