【摘 要】
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兔巴氏杆菌病(Rabbit Pasteurellosis)是一种由多杀性巴氏杆菌引起的呼吸道传染病。不同年龄兔均可发病,发病率和病死率都很高,严重影响养兔业的发展。本研究建立了兔巴氏杆
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兔巴氏杆菌病(Rabbit Pasteurellosis)是一种由多杀性巴氏杆菌引起的呼吸道传染病。不同年龄兔均可发病,发病率和病死率都很高,严重影响养兔业的发展。本研究建立了兔巴氏杆菌的PCR及抗体的ELISA检测方法,可用于该病的临床快速诊断及血清学监测。以兔多杀性巴氏杆菌的高度保守的16S rRNA为靶基因,参考已公布的多杀性巴氏杆菌的16S rRNA基因设计1对特异性引物,优化PCR反应条件,建立了兔多杀性巴氏杆菌PCR快速检测方法。该PCR方法的敏感性达到60cfu/mL,使用建立的PCR方法扩增兔多杀性巴氏杆菌标准株和分离株均能扩增出的643bp的目的片段,扩增兔大肠杆菌、支气管败血波氏杆菌结果为阴性,证明本试验所建立的兔多杀性巴氏杆菌病原PCR检测方法敏感、特异、可靠。根据多杀性巴氏杆菌外膜蛋白A (OmpA)基因序列,设计1对特异性引物,将PCR扩增的基因片段定向插入原核表达载体pET28a(+)中,构建了原核表达质粒pET-OmpA,转化到宿主菌BL21(DE3),并对重组蛋白表达条件、纯化条件进行优化；Western blot分析表明OmpA重组蛋白具有免疫原性,能被兔多杀性巴氏杆菌阳性血清识别。兔多杀性巴氏杆菌OmpA重组蛋白的成功表达,为开展该基因功能研究和血清学检测方法的建立奠定了基础。用纯化的兔多杀性巴氏杆菌OmpA重组蛋白作为包被抗原,初步建立了检测兔多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA方法,优化并确定了ELISA最佳工作条件,即抗原包被浓度为8μg/mL,4℃封闭过夜,血清(1：200)和酶标羊抗兔IgG二抗(1：10 000),在37℃分别温育60min和90min,底物溶液37℃显色15min。特异性和重复性实验结果显示,建立的ELISA方法特异性好、重复性高。
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