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目的: 研究肝癌细胞系 LM3经微球体培养后对干细胞相关蛋白Oct-4、Sox2、Wnt-5b、Nanog表达的影响，同时对微球体的特征进行鉴定,为肝癌干细胞的研究提供实验基础。 方法: 应用干细胞培养体系和微球体悬浮培养法从肝癌细胞系LM3中富集到微球体，并对微球体进行一系列的特征鉴定。包括：（1）微球体形成时间及大小；（2）蛋白质免疫印迹及免疫荧光检测LM3细胞与微球体细胞中干细胞相关蛋白Oct-4、Sox2、Wnt-5b、Nanog表达；（3）蛋白质免疫印迹检测LM3细胞与微球体细胞中p-ERK1/2、ERK1/2、p-AMPK、AMPK表达；（4）蛋白质免疫印迹检测 LM3细胞与微球体细胞中 EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达，免疫荧光检测LM3细胞与微球体细胞中EMT相关蛋白E-cadherin表达；（5）MTT实验检测LM3细胞与微球体细胞对阿霉素耐受能力；（6）划痕实验检测LM3细胞与微球体细胞迁移能力；（7） NOD／SCID小鼠皮下成瘤实验检测LM3细胞与微球体细胞成瘤能力。 结果: （1）干细胞培养体系和微球体悬浮培养法可以使肝癌细胞快速形成微球体，培养至第7天时，微球体的直径可以达到450μm；（2）蛋白质免疫印迹检测及免疫荧光检测结果显示微球体细胞中干细胞相关蛋白Oct-4、Sox2、Wnt-5b、Nanog的表达量均高于LM3细胞（P<0.01或P<0.05）；（3）蛋白质免疫印迹检测结果显示微球体细胞中p-ERK1/2、ERK1/2的表达量高于LM3细胞（P<0.001），p-AMPK、AMPK的表达量低于LM3细胞（P<0.001）；（4）蛋白质免疫印迹检测结果显示微球体细胞中E-cadherin的表达量高于LM3细胞（P<0.05），N-cadherin、Vimentin的表达量低于LM3细胞（P<0.001或P<0.05）；免疫荧光检测结果显示微球体细胞中E-cadherin的表达量高于LM3细胞；（5）MTT实验检测结果显示微球体细胞耐受阿霉素的能力比 LM3细胞强（P<0.05）；（6）划痕实验检测结果显示微球体细胞的迁移能力比LM3细胞强（P<0.01）；（7）NOD／SCID小鼠皮下成瘤实验检测结果显示微球体细胞的成瘤能力比LM3细胞强。 结论: 干细胞培养体系和微球体悬浮培养法可以使肝癌细胞系LM3快速形成微球体，微球体细胞中干细胞相关蛋白Oct-4、Sox2、Wnt-5b、Nanog的表达量均增高，p-ERK1/2、ERK1/2的表达量增高, p-AMPK、AMPK的表达量降低，微球体细胞耐受阿霉素的能力、迁移能力、成瘤能力均增强的原因可能是微球体细胞干性增强所致，该微球体细胞可能就是肝癌干细胞。