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蛋白质的N-糖基化在细胞信号传导、受精、增殖和分化等生物过程中起重要作用，越来越多的研究表明N-聚糖与癌症、糖尿病和心力衰竭等许多疾病的发生与发展密切相关。N-聚糖的分析研究在对人类疾病的进一步理解和有效治疗等方面展现出巨大潜力。由于连接N-聚糖的微不均一性以及结构多样性，全面地研究N-聚糖的工作异常困难。应用于N-聚糖分析的方法主要有高效液相色谱(HPLC)，毛细管电泳(CE)，质谱(MS)和上述技术联用等。N-聚糖分析的样品制备包括酶切、纯化、标记、再纯化等一系列步骤。现有方法中，复杂的样品制备和有限的分析灵敏度限制了它在临床上的广泛应用。因此，快速、高效和高灵敏度的N-聚糖分析越来越有意义，并且也具有较大的研究发展空间。具体研究工作如下：
首先建立了一种微波辅助PNGaseF快速酶切方法，在20min内实现了N-聚糖的完全释放，酶切后的N-聚糖还原端在短时间内会以糖胺的形式存在；其中直接的糖胺标记，可以省略酶切后对N-聚糖的纯化，极大地缩短了N-聚糖分析的样品制备过程。结合(N-琥珀酰亚胺基氧代羰基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化膦(TMPP-Ac-OSu)标记糖胺和甲胺化的双标记策略，N-聚糖的MALDI-MS分析灵敏度增强了35倍，并获得了低至10fmol的定量检测限；同时从仅50nL的血清样本中检测到54种N-聚糖结构，超过了常用的血清N-聚糖分析方法10倍灵敏度。
但是，MALDI-MS在定量分析方面略微有些不足，因此一种糖胺荧光标记试剂6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)结合亲水相互作用液相色谱荧光检测(HILIC-FLD)用于N-聚糖定量分析的方法被进一步提出。与传统的N-聚糖荧光分析方法相比，整个N-聚糖制备时间从20h缩短到50min，检测灵敏度提高了10倍。此方法具有好的定量线性(R2＞0.991)以及重现性(RSD＜8.7%)。应用建立的方法并结合一系列统计学分析，揭示了人血清中核心岩藻糖基化，单、双唾液酸化的N-聚糖与肺癌的发生与发展显著相关。
HILIC已成为一种强有力的N-聚糖分析技术，而衍生后的N-聚糖也可以使用反相液相色谱(RPLC)和正向液相色谱(NPLC)分析。因此我们对比分析了不同条件下N-聚糖AQC衍生物(中性和酸性结构)在HILIC、NPLC和RPLC分离过程中的色谱行为和荧光响应。结果表明：在对于酸性的衍生物，NPLC比HILIC的分离更理想，但是在分析的重现性和适用性方面则有些受限；RPLC则对两类衍生物的选择性和保留性均较低造成严重的共洗脱的现象；而HILIC同时对两类衍生物均具有好的分离和选择性，特别是在分析复杂样品(如血清)具有更大的优势。
然而HILIC分析N-聚糖的样品准备过程中，AQC标记后的多步纯化以及分析前的浓缩和复溶等一系列步骤限制了其分析效率。为解决这一问题，我们建立了超滤管辅助纯化方法，成功实现了目标物的直接HILIC分析。在获得衍生物回收率增强的同时，显著地较现有的一般分析方法和N-聚糖AQC衍生物多步纯化方法，在样品制备时间分别降低了25和6倍。鉴定了可用于口腔疾病诊断以及预测其发展的特异性糖生物标志物Hex5HexNAc4Neu5Ac1：从健康状态到口腔炎症状态显著上调，而当口腔炎症状态转变为口腔癌时则出现显著下调。并利用96孔板为载体探究了N-聚糖的样品制备并获得了好的稳定性(RSD＜10%)，为高通量分析提供了技术基础。
对N-聚糖分析的样品制备进行在线以及自动化分析，可以增加分析检测的通量和降低分析的成本。为达到此目的，在上述研究的基础上结合微流控芯片平台，通过不同类型的N-聚糖结构对样品准备的酶切、衍生和纯化过程进行探究和验证，最终成功实现了30min的在线N-聚糖样品制备。并通过人血清中的N-聚糖分析证明了它是一种简单和适用性强的方法。
综上所述，本文利用微波辅助酶切、糖胺标记和微流控芯片等技术，结合HPLC、基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)等平台，对N-聚糖分析的样品制备过程进行了系统的研究，建立了快速高效的N-聚糖定性以及定量方法和N-聚糖的在线制备，并研究了其在生物学上的相关应用，为临床高效的糖组学分析提供了新途径。
首先建立了一种微波辅助PNGaseF快速酶切方法，在20min内实现了N-聚糖的完全释放，酶切后的N-聚糖还原端在短时间内会以糖胺的形式存在；其中直接的糖胺标记，可以省略酶切后对N-聚糖的纯化，极大地缩短了N-聚糖分析的样品制备过程。结合(N-琥珀酰亚胺基氧代羰基甲基)三(2,4,6-三甲氧苯基)溴化膦(TMPP-Ac-OSu)标记糖胺和甲胺化的双标记策略，N-聚糖的MALDI-MS分析灵敏度增强了35倍，并获得了低至10fmol的定量检测限；同时从仅50nL的血清样本中检测到54种N-聚糖结构，超过了常用的血清N-聚糖分析方法10倍灵敏度。
但是，MALDI-MS在定量分析方面略微有些不足，因此一种糖胺荧光标记试剂6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)结合亲水相互作用液相色谱荧光检测(HILIC-FLD)用于N-聚糖定量分析的方法被进一步提出。与传统的N-聚糖荧光分析方法相比，整个N-聚糖制备时间从20h缩短到50min，检测灵敏度提高了10倍。此方法具有好的定量线性(R2＞0.991)以及重现性(RSD＜8.7%)。应用建立的方法并结合一系列统计学分析，揭示了人血清中核心岩藻糖基化，单、双唾液酸化的N-聚糖与肺癌的发生与发展显著相关。
HILIC已成为一种强有力的N-聚糖分析技术，而衍生后的N-聚糖也可以使用反相液相色谱(RPLC)和正向液相色谱(NPLC)分析。因此我们对比分析了不同条件下N-聚糖AQC衍生物(中性和酸性结构)在HILIC、NPLC和RPLC分离过程中的色谱行为和荧光响应。结果表明：在对于酸性的衍生物，NPLC比HILIC的分离更理想，但是在分析的重现性和适用性方面则有些受限；RPLC则对两类衍生物的选择性和保留性均较低造成严重的共洗脱的现象；而HILIC同时对两类衍生物均具有好的分离和选择性，特别是在分析复杂样品(如血清)具有更大的优势。
然而HILIC分析N-聚糖的样品准备过程中，AQC标记后的多步纯化以及分析前的浓缩和复溶等一系列步骤限制了其分析效率。为解决这一问题，我们建立了超滤管辅助纯化方法，成功实现了目标物的直接HILIC分析。在获得衍生物回收率增强的同时，显著地较现有的一般分析方法和N-聚糖AQC衍生物多步纯化方法，在样品制备时间分别降低了25和6倍。鉴定了可用于口腔疾病诊断以及预测其发展的特异性糖生物标志物Hex5HexNAc4Neu5Ac1：从健康状态到口腔炎症状态显著上调，而当口腔炎症状态转变为口腔癌时则出现显著下调。并利用96孔板为载体探究了N-聚糖的样品制备并获得了好的稳定性(RSD＜10%)，为高通量分析提供了技术基础。
对N-聚糖分析的样品制备进行在线以及自动化分析，可以增加分析检测的通量和降低分析的成本。为达到此目的，在上述研究的基础上结合微流控芯片平台，通过不同类型的N-聚糖结构对样品准备的酶切、衍生和纯化过程进行探究和验证，最终成功实现了30min的在线N-聚糖样品制备。并通过人血清中的N-聚糖分析证明了它是一种简单和适用性强的方法。
综上所述，本文利用微波辅助酶切、糖胺标记和微流控芯片等技术，结合HPLC、基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)等平台，对N-聚糖分析的样品制备过程进行了系统的研究，建立了快速高效的N-聚糖定性以及定量方法和N-聚糖的在线制备，并研究了其在生物学上的相关应用，为临床高效的糖组学分析提供了新途径。