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肝脏是人体内非常重要的消化器官,具有糖原存储、蛋白质合成、脂肪乳化、胆汁分泌和解毒等功能。其发挥正常的生理功能对维持人体的健康至关重要。然而与脊椎动物其他器官相比,肝脏有着非常强大的再生能力。因此,肝脏再生过程中细胞间相互作用以及分子机制的研究对医学的发展和人类健康的保障具有重要的意义。虽然近年来对肝脏再生的研究已经比较深入,但是肝脏再生过程中会涉及非常复杂的机制,在不同类型肝脏损伤背景下,其再生的机制是不同的,因此很难用单一的模型来阐述肝脏再生的机制。本实验用斑马鱼作为模式生物,斑马鱼早期胚胎透明可见,可以很好的观察细胞间的相互作用。使用硝基还原酶（Nitroreductase,NTR）/甲硝唑（Metronidazole,Mtz）系统可对肝脏进行诱导损伤,Mtz处理后几乎可以将全部的肝实质细胞诱导死亡,并且在撤除药物处理后48小时内,肝脏能够通过再生恢复原有大小。因此斑马鱼NTR/Mtz模型是研究肝脏急性严重损伤后再生过程中细胞间相互作用以及分子机制的良好模型。肝星状细胞是肝脏内特异的间充质细胞,在肝脏发挥正常生理功能以及在纤维化形成的过程中都起着重要的作用。肝星状细胞位于肝脏的Disse腔中,与窦状隙血管内皮细胞和肝脏上皮细胞保持着紧密的相互作用。在正常的肝脏中,肝星状细胞处于静止状态,占据肝脏总细胞数的5%-8%,主要行使着储存、代谢维甲酸和脂肪的作用。当肝脏受到损伤后,肝星状细胞受到刺激会被激活并转分化成为肌成纤维细胞。活化的肝星状细胞具有很强的增殖能力并且会生产大量的细胞外基质,分泌大量的细胞因子、生长因子和趋化因子。然而肝星状细胞对肝脏再生的作用一直存在着争议。研究最多的是在慢性肝脏疾病中,肝星状细胞持续激活导致肝脏纤维化,最终导致肝脏结构和功能的紊乱,从而抑制肝脏的再生,因此抑制肝星状细胞的活化和增殖会促进肝脏的再生。在一些急性损伤中,肝星状细胞分泌的细胞因子和生长因子是肝脏前体细胞增殖和分化所必需的,活化的肝星状细胞可以促进肝脏的再生。甚至在某些特定条件下肝星状细胞可直接转分化成肝实质细胞。本实验运用斑马鱼NTR/Mtz肝脏急性严重损伤模型对肝星状细胞在肝脏再生过程中的作用进行了初步的探究。本实验首先运用同源重组的方式构建了能够在斑马鱼中标记肝星状细胞的hand2:GFP重组细菌人工染色体（BAC）,并通过胚胎注射和多代遗传筛选获得了稳定的转基因斑马鱼系。相较于传统方法而言,通过细菌人工染色体构建转基因斑马鱼的优势是:细菌人工染色体能够携带大量的核酸,通常包含一个基因的完整结构,尤其是调控该基因的完整顺式作用元件。因此通过这种方式构建的转基因斑马鱼能够通过报告基因的表达更加准确的反映一个基因的表达模式。通过同源重组构建重组细菌人工染色体的步骤分为2步。第一步将itol2转座子序列以及氨苄青霉素基因序列同源重组在原始细菌人工染色体上,由于细菌人工染色体自身携带氯霉素抗性,因此只需在含有氯霉素和氨苄青霉素的LB培养基中就能筛选出发生同源重组的细菌人工染色体。第二步将报告基因序列和卡那霉素基因序列同源重组在细菌人工染色体上,在含有氯霉素、氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养基中就能筛选出最终所需的重组细菌人工染色体。这种操作细菌人工染色体的方法较为简单,只需在引物的5’端加上50bp的同源臂,然后通过PCR即可获得重组元件,再将重组元件转化到含有原始细菌人工染色体的SW102感受态细胞中,通过同源重组将目的序列整合在原始细菌人工染色体上。同时向胚胎中注射重组细菌人工染色体和tol2 m RNA,并获得有荧光标记的F0代转基因斑马鱼。通过斑马鱼遗传筛选获得能够稳定遗传的Tg（hand2:GFP）BAC斑马鱼转基因系。为了验证转基因表达模式的正确性,我们通过转基因鱼系GFP的表达与hand2基因全胚胎原位杂交实验结果进行对比。结果显示在胚胎受精后的24小时,48小时以及72小时时转基因斑马鱼荧光表达模式与hand2全胚胎原位杂交的实验结果一致。肝脏在胚胎受精后的第5天时成熟,此时在激光共聚焦显微镜下可观察到肝脏内部的肝星状细胞。为了探究肝星状细胞在斑马鱼肝脏严重损伤后再生过程中的作用,我们将转基因斑马鱼Tg（hand2:GFP）BAC与Tg（lfabp:m Cherry-NTR）杂交获得双转基因斑马鱼。在胚胎受精后的第五天,通过Mtz的诱导对肝脏进行急性严重损伤。在肝脏完全受损后,肝星状细胞开始失去原有的星状形态,并变成不规则形态。在再生8小时,肝实质细胞未再生,不规则的肝星状细胞包裹并且充满整个肝脏区域。再生24小时,肝实质细胞开始再生,不规则的肝星状细胞围绕并包裹着新生的肝实质细胞,相较于再生8小时,其形态有所恢复。再生48小时,肝实质细胞基本完成再生,肝星状细胞也恢复到了原本的形态。在肝脏再生8小时的时候,肝星状细胞几乎充斥在整个肝脏区域,为了验证此时的肝星状细胞是否发生了增殖,还是仅仅发生了形态上的变化,我们进行了EDU实验,结果显示与肝脏未损伤的和肝脏极度损伤后再生0小时的肝星状细胞相比,肝脏再生8小时时肝星状细胞有大量的增殖。本实验通过同源重组细菌人工染色体的方式构建了能够在斑马鱼中标记肝星状细胞的转基因鱼系Tg（hand2:GFP）BAC。并发现在肝脏急性严重受损后的早期,肝脏还未再生时,肝星状细胞的形态发生改变并且存在大量增殖,最终充斥在整个肝脏区域中。然而伴随着肝脏的再生,最终肝星状细胞基本回退到了原始的状态。本实验构建的模型可利用斑马鱼早期胚胎易于观察的特点,研究肝星状细胞在肝脏严重受损后对肝脏再生的作用以及肝星状细胞活化的机理。相反,也可探索肝星状细胞活化后回退的机理,为肝脏纤维化的治疗提供帮助。