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第一部分四个中国汉族遗传性多发性外生性骨疣家系的致病基因突变研究
目的：
遗传性多发性外生性骨疣(hereditary multiple exostoses，HME)是一种累及软骨化骨的以骨骼系统多发性外生性骨疣为特征的疾病，常见于长骨干骺端。HME发病率在西方人群约1/50，000，为常染色体显性遗传病，具有遗传异质性，目前研究结果显示该病致病基因主要为EXT1和EXT2基因。
EXT1基因定位于8q24.11-q24.13，全长约250kb，包含11个外显子，编码746个氨基酸。EXT2基因定位于11p11-p12，基因长约110kb，包含14个外显子，编码718个氨基酸。EXT1基因和EXT2基因分别编码Exostosin-1蛋白和Exostosin-2蛋白，它们均为Ⅱ型跨膜糖蛋白，定位于内质网，二者均为具有D-葡萄糖醛酸(GlcA)转移酶活性和N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)转移酶活性的硫酸乙酰肝素聚合酶(HS-Pol)，参与硫酸乙酰肝素的合成。Exostosin-1与Exostosin-2形成异源二聚体，该二聚体相比于二者单独存在时其糖基转移酶的活性大大增高。到目前为止，与HME相关的EXT1基因突变已经超过429种，EXT2基因突变已经超过222种，大多数突变是产生移码的插入突变和缺失突变，无义突变和剪接位点的突变也有所报道。
本文以4个中国汉族HME家系为研究对象，对EXT1和EXT2基因进行DNA测序来筛查突变，通过限制性片段长度多态性分析（restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP）对突变进行验证，排除单核苷酸多态性(Single NucleotidPolymorphism，SNP)。并对所筛查到的剪接位点突变，联合应用体外剪接分析工具及体内mRNA水平检测进行剪接位点突变所导致的异常剪接效应分析。
材料与方法：
一、实验材料
中国医科大学附属盛京医院和辽宁省人民医院收集的4个中国汉族HME家系，临床表现与HME既往报道相符，临床诊断明确。在签署书面的知情同意书后，对家系中4名先证者采集血样（其中患者4例，男2例、女2例）。
二、方法
1、致病基因EXT1和EXT2的DNA测序
PCR扩增患者EXT1和EXT2基因所有外显子及包括剪接位点的侧翼序列，PCR产物回收纯化后进行DNA测序。
2、PCR-RFLP分析
根据测序发现的突变设计1个错配引物，引入PmaCⅠ限制性酶切位点。在100名无关正常个体中进行限制性片段长度多态分析。
3、EXT1和EXT2基因突变的体外mRNA水平分析
我们应用MINIpCAS载体，分别构建EXT1和EXT2基因野生型和剪接位点突变型的MINIGENE转染HeLa细胞，RT-PCR分析后，测序对比野生型和突变型MINIGENE cDNA的改变，体外验证剪接位点突变后所引起的异常剪接效应。
4、EXT1基因突变的体内mRNA水平分析
从家系1先证者新鲜血液样本中提取总RNA，反转录成为cDNA，RT-PCR扩增包括突变位点及其上下游外显子的片段，测序验证所产生的异常转录产物。
实验结果：
1、基因突变检测结果
家系1的先证者EXT1基因检测到剪接位点突变c.1883+1G＞A。
家系2的先证者EXT2基因检测到剪接位点突变c.1173+1G＞T。
家系3的先证者所有EXT1，EXT2基因的外显子及其侧翼序列及EXT2基因的5UTR，3UTR区域均未筛查到致病基因突变。
家系4的先证者EXT2基因检测到无义突变c.544C＞T（p.Arg182*）。
2、PCR-RFLP分析结果
家系1的先证者所检测到的突变在人类突变数据库和多发性软骨瘤数据库及PubMed文献上均未见报道。在100名无关正常人群中进行PCR-RFLP分析，均未见到该变异，排除SNP。
3、EXT1和EXT2基因突变的体外mRNA水平分析结果
家系1的EXT1基因剪接位点突变c.1883+1G＞A的体外剪接分析结果为六个隐蔽性剪接位点的激活。其中有四个位点存在于外显子9:两个导致整码突变，位于原始剪接位点上游69bp和111bp，分别缺失了23个（p.Trp606_Lys628del）和37个氨基酸(p.Tyr592_Lys628del);另外两个位点位于原始剪接位点上游161bp和29bp，导致移码突变，分别产生598个氨基酸残基(p.Ile575fs*25)和642个氨基酸残基的截短蛋白(p.Ile619fs木25);还有两个位点存在于内含子9，分别位于原始剪接位点下游201bp和257bp，它们共同的异常剪接效应是从628位氨基酸开始产生移码突变，并在629位提前产生终止密码子(p.Lys628fs*2)。
家系2的EXT2基因剪接位点突变c.1173+1G＞T的体外剪接分析结果为外显子7跳跃。由于外显子7跳跃，产生移码突变，从360位氨基酸开始移码，编码了43个新的氨基酸后提前产生终止密码子(p.Arg360fs*45)。
4、EXT1基因突变的体内mRNA水平分析结果
家系1 EXT1: c.1883+1G＞A剪接位点突变，体内mRNA分析结果为检测到两个位于外显子9的隐蔽性剪接位点的激活，与体外剪接分析中检测到的产生整码突变的两个隐蔽性剪接位点相同，没有检测到体外剪接分析中激活的产生移码突变的其他四个隐蔽性剪接位点。
结论：
在HME家系中检测到新的剪接位点突变EXT1: c.1883+1G＞A，此突变是该中国汉族HME家系1的致病突变。在中国汉族HME家系2和4中分别检测到EXT2基因已知致病基因突变c.1173+1G＞T和c.544C＞T。对两例剪接位点突变进行mRNA水平的异常剪接效应分析，结果分别为:EXT1: c.1883+1G＞A激活了隐蔽性剪接位点;EXT2: c.1173+1G＞T发生了外显子跳跃。
第二部分两个中国汉族骨斑点症家系的致病基因突变筛查和功能分析
目的：
骨斑点症（Osteopoikilosis，OPK，OMIM166700）是一种罕见病，是由于骨内具有弥漫性斑点状致密骨质而得名。当骨斑点症合并有皮肤改变时又称为科斯综合症(Buschke-Ollendorff syndrome，BOS，OMIM166700)。该病为常染色体显性遗传，其致病基因为LEMD3基因。LEMD3基因位于12q12-14.3，全长79kb，包含13个外显子，编码911个氨基酸。
LEMD3基因编码蛋白质LEMD3(LAP2-emerin-MAN1domain-containingprotein3)。LEMD3为核膜内在蛋白，其羧基末端结构域位于699-911位氨基酸，是SMAD(Sma-and Mad Homologue)结合位点。LEMD3通过与SMAD蛋白家族结合，抑制TGF-β和BMP信号通路的活性，TGF-β和BMP是影响胚胎期骨骼发育的两个重要信号转导途径。当LEMD3基因突变，失去结合SMAD的能力，丧失对TGF-β和BMP信号途径的负反馈调节作用，致使这两个信号转导途径下游基因的表达增强，从而导致骨生成增加而引起骨发育异常的相关疾病。
迄今为止已经报道了22种与骨斑点症相关的LEMD3突变位点，其中包括无义突变、移码突变和剪接位点突变。它们的共同特点是由于提前出现终止密码子而形成截短蛋白，缺乏LEMD3蛋白羧基末端的SMAD结合区域，影响其与SMAD的结合，从而不能正常地调节TGF-β和BMP信号转导通路，使骨生成增加，导致骨斑点症。我们在两个骨斑点症家系中分别筛查到LEMD3基因的一个剪接位点突变和一个无义突变，对剪接突变所产生的异常剪接效应进行分析，并且对两个突变所产生的异常蛋白质的功能变化进行分析和检测。
材料与方法：
一、实验材料
中国医科大学附属第一医院和附属盛京医院收集的来自中国辽宁的两个骨斑点症家系，X光片及临床特征均符合骨斑点症诊断。在签署书面的知情同意书后，对两个家系中的先证者采集血样。
二、实验方法
（一）、提取先证者外周血DNA，进行致病基因DNA测序
PCR扩增患者致病基因LEMD3所有外显子及其包含剪接位点的侧翼序列，PCR产物回收纯化后进行DNA测序。
（二）、PCR-RFLP分析
根据测序发现的突变位点设计1个错配引物，产生MspⅠ限制性酶切位点。在100名无关正常个体中进行PCR-RFLP验证。
（三）、LEMD3基因突变的体外mRNA水平分析
我们应用pcDNA3.1(+)载体，分别构建LEMD3基因野生型和剪接位点突变型的MINIGENE，转染HeLa细胞，RT-PCR检测后，测序对比野生型和突变型MINIGENE cDNA的改变，体外验证剪接位点突变后所引起的异常剪接效应。
（四）、LEMD3基因突变的体内mRNA水平分析
从患者新鲜血液样本中提取总RNA，反转录成为cDNA，RT-PCR扩增包括突变点及其上下游外显子的片段，测序验证所产生的异常转录产物。
（五）、LEMD3基因突变的功能研究
1、突变型LEMD3载体的构建
以野生型LEMD3质粒(pSVK3-Flag-LEMD3-WT)为模板，分别构建剪接位点突变和无义突变的LEMD3突变型载体。
2、Western Blot方法检测突变型LEMD3蛋白的变化
将野生型LEMD3质粒(pSVK3-Flag-LEMD3-WT)和突变型LEMD3质粒（pSVK3-Flag-LEMD3-MTsplice， pSVK3-Flag-LEMD3-MTnonsense）分别转染HEK293细胞，提取总蛋白，Western Blot检测突变型相对于野生型的LEMD3蛋白变化。
3、双荧光素酶报告基因检测系统研究突变后的LEMD3对相关信号通路的影响
将野生型或突变型LEMD3质粒与TGF-β信号通路的荧光素酶报告基因载体p3TP-LUX或BMP信号通路的荧光素酶报告基因载体pBRE-LUC共转染C2C12细胞，观察LEMD3突变后对以上两个信号通路的影响。
4、免疫共沉淀及Westem Blot方法检测LEMD3蛋白与SMAD蛋白的相互作用
将野生型或突变型LEMD3质粒与SMAD1或SMAD2全长的载体共转染HEK293细胞，应用免疫共沉淀方法及Western Blot方法检测LEMD3蛋白与SMAD蛋白的相互作用。
结果：
1、LEMD3基因突变检测结果
家系1的先证者检测到剪接位点突变c.2573-2 delA。
家系2的先证者检测到无义突变c.1323 C＞A（p.Tyr441*）。
2、PCR-RFLP分析结果
家系1的先证者检测到的变异在人类突变数据库和PubMed文献上均未见报道。在100名无关正常人群中进行PCR-RFLP分析，均未发现该变异，排除SNP。
3、剪接位点突变的体外剪接分析结果
家系1的剪接位点突变c.2573-2 delA为内含子12受体剪接位点的消失，体外剪接分析的结果显示:该剪接突变所产生的异常剪接效应为内含子12保留。由于内含子12保留后产生移码突变效应，从858位氨基酸开始移码，在产生16个新的氨基酸后，在874位提前形成终止密码子(p.Glu858fs*17)。
4、剪接位点突变的体内mRNA分析结果
体内mRNA的剪接验证结果同样为内含子12保留，与体外剪接分析结果一致。
5、LEMD3基因突变的功能研究
构建了剪接位点突变和无义突变的LEMD3突变型质粒并经测序验证，已经转染HEK293细胞，提取蛋白，应用Western Blot检测突变后LEMD3蛋白相对于野生型LEMD3蛋白的变化;双荧光素酶报告基因检测工作已经预实验确定各组质粒转染的量及刺激因子重组蛋白TGFβ1和ALK3的加入量及刺激时间;SMAD蛋白表达载体经测序验证构建成功，已经分别和野生型及突变型LEMD3质粒共转染HEK293细胞，进行免疫共沉淀实验。以上实验的实验数据和图表的结果正在整理中。
结论：
在骨斑点症家系1中筛查到一个未报道的突变c.2573-2 delA，该突变为剪接突变，mRNA水平分析显示剪接位点突变所产生的异常剪接效应为内含子12保留。在骨斑点症家系2中筛查到既往已报道的无义突变c.1323 C＞A（p.Tyr441*）。