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研究目的和意义：
缺血性心脏病（Ischemicheartdisease，IHD）发病率逐年上升，严重威胁人类健康。IHD最有效的治疗策略是再灌注。然而，再灌注本身可导致进一步的组织损伤，即心肌缺血再灌注损伤（myocardialischemia/reperfusion,MI/R）。目前临床上尚缺乏有效的干预手段，因此迫切需要探索心肌保护的新靶点。
脂肪因子由脂肪组织分泌，主要通过旁分泌调节心血管结构和功能。有研究报道MI/R时，脂肪因子可通过抗氧化、抗凋亡等机制保护心肌。Asprosin是新的脂肪因子。禁食后，Asprosin激活G蛋白-cAMP-PKA通路促进肝细胞葡萄糖释放。最新研究表明，Asprosin可能是预测急性冠脉综合征血管病变严重程度的新的标记物。Asprosin能否在MI/R损伤中发挥心肌保护作用目前尚未见报道。因此，本研究旨在：（1）利用大肠杆菌（Escherichiacoli,E.Coli）重组蛋白表达系统制备重组人Asprosin（Recombinanthumanasprosin，rAsp）；（2）明确rAsp对MI/R的作用。
研究方法：
第一部分：（1）根据E.coli密码子偏好性优化Asprosin序列并进行基因合成。（2）构建重组表达质粒pET30a-Asp并转化至E.coli感受态细胞；筛选阳性转化子并以异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）诱导表达rAsp。（3）rAsp经镍柱亲和层析、透析脱盐、Pierce离心式内毒素去除柱脱除内毒素和超滤浓缩等步骤后得到纯化的rAsp。
第二部分：（1）在体实验：30只C57BL/6J小鼠随机分为3组：假手术组（sham）、心肌缺血再灌注组（MI/R）、MI/R损伤并注射rAsp组（MI/R+rAsp）；通过心动超声检测评价心功能。（2）离体实验：分离SD大鼠乳鼠原代心肌细胞（Neonatalratcardiomyocytes,NCM），分别在刚接种时、24、48和72h后观察心肌细胞的形态，并通过免疫荧光染色鉴定；将NCM分为3组:对照组（Control，Ctrl）、缺血再灌注损伤组（ischemia/reperfusion，I/R）和I/R并给予rAsp组（I/R+Asp）；分别用CCK-8法测定细胞活力；试剂盒检测caspase3酶活性；TUNEL法检测细胞凋亡；WesternBlot检测Bcl-2和Bax表达。
研究成果：
1.成功克隆人Asprosin序列，IPTG诱导表达并纯化Asprosin蛋白。首先，测序结果表明，克隆的基因序列和优化后的人Asprosin基因序列一致，并且成功构建了重组质粒pET-30a-Asp。其次，构建了高效表达Asprosin的原核表达菌株；原核初步表达结果提示重组蛋白存在于上清中，并确定了Asprosin最佳诱导条件为16℃诱导24h，200rp/min，IPTG终浓度为1mmol/L；最后，镍柱亲和纯化得到目标蛋白。SDS-PAGE后行考马斯亮蓝染色鉴定纯度，目标蛋白纯度大于95%；WestrenBlot分析纯化得到的是Asprosin蛋白；LAL法测定内毒素含量小于0.1EU/μg。
2.外源性给予rAsp改善小鼠MI/R损伤后的心脏功能。与Sham组相比，MI/R组小鼠左心室前壁舒张功能下降，左室射血分数（LVEF）降低（p＜0.05），说明MI/R损伤模型构建成功。与MI/R组相比，外源性给予rAsp后，小鼠心脏功能改善，LVEF升高（p＜0.05）、左室短轴缩短率（LVFS）升高（p＜0.05）和左室收缩末期容积（LVESV）下降（p＜0.05）。
3.rAsp可抑制心肌细胞凋亡，减轻I/R损伤。与Ctrl比较，I/R损伤后，心肌细胞活力降低（p＜0.001）、凋亡数量增加（p<0.001）、caspase3活性增加（p＜0.001）、抗凋亡因子bcl-2表达减少（p<0.001）、bcl-2/bax比值降低（p＜0.001）和促凋亡因子bax表达增加（p＜0.001），差异均有统计学意义；rAsp处理后，心肌细胞活力增加（p＜0.01）、凋亡数量减少（p＜0.001）、caspase3活性被抑制（p＜0.05）、bcl-2表达上调（p＜0.05），bcl-2/bax比值上升（p＜0.001）和bax表达减少（p＜0.001），差异均有统计学意义。
结论及意义
1.成功克隆人Asprosin基因序列，构建Asprosin的原核表达载体，获得稳定表达的工程菌株。初步探索优化了重组人Asprosin的表达条件及蛋白纯化，最终得到符合医学实验要求的重组Asprosin。
2.首次发现Asprosin具有抗MI/R作用，是一个保护性脂肪因子，为明确其生物学功能打下基础；
3.首次发现Asprosin可减低心肌细胞的凋亡水平，改善心功能，从而减轻MI/R损伤。
缺血性心脏病（Ischemicheartdisease，IHD）发病率逐年上升，严重威胁人类健康。IHD最有效的治疗策略是再灌注。然而，再灌注本身可导致进一步的组织损伤，即心肌缺血再灌注损伤（myocardialischemia/reperfusion,MI/R）。目前临床上尚缺乏有效的干预手段，因此迫切需要探索心肌保护的新靶点。
脂肪因子由脂肪组织分泌，主要通过旁分泌调节心血管结构和功能。有研究报道MI/R时，脂肪因子可通过抗氧化、抗凋亡等机制保护心肌。Asprosin是新的脂肪因子。禁食后，Asprosin激活G蛋白-cAMP-PKA通路促进肝细胞葡萄糖释放。最新研究表明，Asprosin可能是预测急性冠脉综合征血管病变严重程度的新的标记物。Asprosin能否在MI/R损伤中发挥心肌保护作用目前尚未见报道。因此，本研究旨在：（1）利用大肠杆菌（Escherichiacoli,E.Coli）重组蛋白表达系统制备重组人Asprosin（Recombinanthumanasprosin，rAsp）；（2）明确rAsp对MI/R的作用。
研究方法：
第一部分：（1）根据E.coli密码子偏好性优化Asprosin序列并进行基因合成。（2）构建重组表达质粒pET30a-Asp并转化至E.coli感受态细胞；筛选阳性转化子并以异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）诱导表达rAsp。（3）rAsp经镍柱亲和层析、透析脱盐、Pierce离心式内毒素去除柱脱除内毒素和超滤浓缩等步骤后得到纯化的rAsp。
第二部分：（1）在体实验：30只C57BL/6J小鼠随机分为3组：假手术组（sham）、心肌缺血再灌注组（MI/R）、MI/R损伤并注射rAsp组（MI/R+rAsp）；通过心动超声检测评价心功能。（2）离体实验：分离SD大鼠乳鼠原代心肌细胞（Neonatalratcardiomyocytes,NCM），分别在刚接种时、24、48和72h后观察心肌细胞的形态，并通过免疫荧光染色鉴定；将NCM分为3组:对照组（Control，Ctrl）、缺血再灌注损伤组（ischemia/reperfusion，I/R）和I/R并给予rAsp组（I/R+Asp）；分别用CCK-8法测定细胞活力；试剂盒检测caspase3酶活性；TUNEL法检测细胞凋亡；WesternBlot检测Bcl-2和Bax表达。
研究成果：
1.成功克隆人Asprosin序列，IPTG诱导表达并纯化Asprosin蛋白。首先，测序结果表明，克隆的基因序列和优化后的人Asprosin基因序列一致，并且成功构建了重组质粒pET-30a-Asp。其次，构建了高效表达Asprosin的原核表达菌株；原核初步表达结果提示重组蛋白存在于上清中，并确定了Asprosin最佳诱导条件为16℃诱导24h，200rp/min，IPTG终浓度为1mmol/L；最后，镍柱亲和纯化得到目标蛋白。SDS-PAGE后行考马斯亮蓝染色鉴定纯度，目标蛋白纯度大于95%；WestrenBlot分析纯化得到的是Asprosin蛋白；LAL法测定内毒素含量小于0.1EU/μg。
2.外源性给予rAsp改善小鼠MI/R损伤后的心脏功能。与Sham组相比，MI/R组小鼠左心室前壁舒张功能下降，左室射血分数（LVEF）降低（p＜0.05），说明MI/R损伤模型构建成功。与MI/R组相比，外源性给予rAsp后，小鼠心脏功能改善，LVEF升高（p＜0.05）、左室短轴缩短率（LVFS）升高（p＜0.05）和左室收缩末期容积（LVESV）下降（p＜0.05）。
3.rAsp可抑制心肌细胞凋亡，减轻I/R损伤。与Ctrl比较，I/R损伤后，心肌细胞活力降低（p＜0.001）、凋亡数量增加（p<0.001）、caspase3活性增加（p＜0.001）、抗凋亡因子bcl-2表达减少（p<0.001）、bcl-2/bax比值降低（p＜0.001）和促凋亡因子bax表达增加（p＜0.001），差异均有统计学意义；rAsp处理后，心肌细胞活力增加（p＜0.01）、凋亡数量减少（p＜0.001）、caspase3活性被抑制（p＜0.05）、bcl-2表达上调（p＜0.05），bcl-2/bax比值上升（p＜0.001）和bax表达减少（p＜0.001），差异均有统计学意义。
结论及意义
1.成功克隆人Asprosin基因序列，构建Asprosin的原核表达载体，获得稳定表达的工程菌株。初步探索优化了重组人Asprosin的表达条件及蛋白纯化，最终得到符合医学实验要求的重组Asprosin。
2.首次发现Asprosin具有抗MI/R作用，是一个保护性脂肪因子，为明确其生物学功能打下基础；
3.首次发现Asprosin可减低心肌细胞的凋亡水平，改善心功能，从而减轻MI/R损伤。