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急性白血病是造血干祖细胞的恶性克隆性疾病，发病时骨髓中异常原始细胞及幼稚细胞（白血病细胞）大量增殖并抑制正常造血，可广泛浸润肝、脾、淋巴结等各种脏器，表现为贫血、感染、出血和浸润等征象，尤其是髓系白血病（AML）是18岁以上人群中最常见的恶性肿瘤性疾病之一，该病的发病机理和发病过程逐渐被认识，尤其是在细胞水平和分子水平发生发展的理解已经有一定的基础，并且目前遗传学标记对于急髓患者的临床治疗方案的指导有重要意义，且对于预后风险的评估也是至关重要的。尽管所有研究者已经全力开展预后标志物的研究，以期找到相关的预后因素，但AML仍然是预后结果迥异且致死率极高的疾病，致死的原因通常与多种并发症有关。新靶向药物和分子的发现，如蟾蜍二烯内酯（蟾毒它灵），是生物医学和药物肿瘤学的主要研究目标，与化学、药理学、药代动力学、药效学和毒理遗传学研究有关，可以帮助我们设计靶向治疗，新药的发现可作为一种辅助治疗和晚期肿瘤疾病复发的方法，或选择剂型，调整给药方法/途径，减轻痛苦。蟾毒它灵(Bufotalin)是从蟾酥中提取的蟾蜍二烯内酯类化合物，它不仅有强心、对抗心律失常、抗感染作用，还有用于局麻、解热和利尿等，在临床应用广泛，并且对许多实体肿瘤细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用，目前已知的对蟾毒它灵的研究显示，蟾毒它灵能诱导实体肿瘤细胞凋亡，且机制主要和线粒体、死亡受体及内质网等有关，但对血液系统肿瘤这种非实体肿瘤细胞凋亡机制的研究较少,在我们的实验中，研究了随着蟾毒它灵浓度的增加及作用时间的延长，对急性髓系白血病HL-60细胞的影响，研究发现，蟾毒它灵可以抑制急性髓性白血病HL-60细胞的增殖，并通过上调Bax，Cleavedcaspase-9，Cleavedcaspase-8，Cleavedcaspase-3的表达，下调Bcl-2蛋白的表达来实现该凋亡过程。同时，随着蟾毒它灵作用浓度的增加和作用时间的延长，MAPK信号传导通路（p-P38，p-JNK和p-ERK1/2）被激活,P38、JNK、ERK1/2蛋白表达总水平变化不明显。分别用P38抑制剂、JNK抑制剂，ERK1/2抑制剂处理HL-60细胞（抑制剂名称分别为SB203580、SP600125、U0126），结果表明，p-P38和p-JNK及两组的Cleavedcaspase-3蛋白水平表达受抑制，但p-ERK1/2及该组的Cleavedcaspase-3表达变化不明显。进一步研究，检测用蟾毒它灵处理细胞后，P67phox和P22phox的表达被激活，它们是构成超氧化物的亚基。此外，急性髓系白血病M3型的特征性融合基因PML-RaRa的表达也随着蟾毒它灵浓度和时间的增加而降低。总之，我们的研究结果表明，蟾毒它灵可通过浓度和时间依赖的方式，激活ROS/MAPK信号通路诱导急性髓系白血病HL-60细胞凋亡。
目的:
1.通过该实验，明确蟾毒它灵对正常人外周血B淋巴细胞和急性髓系白血病HL-60细胞是否有增殖抑制作用及诱导凋亡作用；
2.通过该实验，研究蟾毒它灵诱导急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的分子机制。
方法:
1.无菌操作下培养正常的人外周血B淋巴细胞和急性髓细胞白血病HL-60细胞；
2.用CCK-8方法检测蟾毒它灵对两种细胞增殖的影响；
3.用流式细胞仪检测蟾毒它灵对急性髓细胞白血病HL-60细胞凋亡的影响，分别以时间和浓度为变量；
4.用Western-Blot技术检测，随着蟾毒它灵浓度的增加和作用时间的延长，HL-60细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8及Cleaved-caspase3的表达情况；
5.用流式细胞仪检测不同浓度的蟾毒它灵对急性髓细胞白血病HL-60细胞中活性氧（ROS）表达的影响，用Western-Blot技术检测P67phox、P22phox蛋白水平的表达；
6.用Western-Blot技术检测，随着蟾毒它灵浓度的增加和作用时间的延长，HL-60细胞MAPK信号通路中p-P38、p-JNK、p-ERK1/2、P38、JNK、ERK1/2蛋白水平的表达；
7.用Western-Blot技术检测不同浓度蟾毒它灵作用下，加入P38、JNK、ERK抑制剂（SB203580、SP600125、U0126）后，p-P38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白水平的表达；
8.用Western-Blot技术检测不同浓度蟾毒它灵作用下，加入氧化抑制剂（NAC）后，P67phox、P22phox蛋白水平的表达；
8.用Western-Blot技术检测不同浓度和不同时间蟾毒它灵作用下，PML-RaRa蛋白水平的表达情况；
9.用GraphPadprism5.0录入至少重复三次的数据并进行统计。
结果:
1.蟾毒它灵对急性髓系白血病HL-60细胞的抑制作用大于正常的人外周血B淋巴细胞的抑制作用，差异有统计学意义；
2.随着蟾毒它灵浓度的增加和时间的延长，诱导急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的作用随之增加，差异有统计学意义；
3.随着蟾毒它灵浓度和时间的增加，HL-60细胞中Bax、Cleavedcaspase-9、Cleavedcaspase-8及Cleavedcaspase-3表达逐渐增加，Bcl-2蛋白水平的表达逐渐降低，差异有统计学意义；
4.随着蟾毒它灵浓度和时间的增加，HL-60细胞p-P38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达增加，P38、JNK、ERK1/2总水平无明显变化，差异有统计学意义；且加入P38抑制剂、JNK抑制剂和ERK1/2抑制剂后，p-P38、p-JNK及同组的Cleaved-caspase3表达明显降低，但p-ERK1/2及同组Cleaved-caspase3表达无明显变化，差异有统计学意义；
5.随着蟾毒它灵浓度的增加，HL-60细胞中活性氧（ROS）的表达增加，P67phox和P22phox的表达增加；然而，加入氧化抑制剂（NAC）后，P67phox和P22phox的表达降低，差异有统计学意义;
7.随着蟾毒它灵浓度和作用时间的增加，HL-60细胞中PML-RaRa表达逐渐降低。
结论:
1.随着浓度和时间的增加，蟾毒它灵抑制急性髓系白血病HL-60细胞的增殖的作用随之增强，且对正常人外周血B淋巴细胞影响较小；
2.随着浓度和时间的增加，蟾毒它灵诱导急性髓系白血病HL-60细胞的凋亡作用增加；
3.蟾毒它灵诱导HL-60细胞凋亡的主要机制是激活ROS/MAPK信号通路；
4.蟾毒它灵能抑制PML-RaRa基因的表达。
目的:
1.通过该实验，明确蟾毒它灵对正常人外周血B淋巴细胞和急性髓系白血病HL-60细胞是否有增殖抑制作用及诱导凋亡作用；
2.通过该实验，研究蟾毒它灵诱导急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的分子机制。
方法:
1.无菌操作下培养正常的人外周血B淋巴细胞和急性髓细胞白血病HL-60细胞；
2.用CCK-8方法检测蟾毒它灵对两种细胞增殖的影响；
3.用流式细胞仪检测蟾毒它灵对急性髓细胞白血病HL-60细胞凋亡的影响，分别以时间和浓度为变量；
4.用Western-Blot技术检测，随着蟾毒它灵浓度的增加和作用时间的延长，HL-60细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase9、Cleaved-caspase8及Cleaved-caspase3的表达情况；
5.用流式细胞仪检测不同浓度的蟾毒它灵对急性髓细胞白血病HL-60细胞中活性氧（ROS）表达的影响，用Western-Blot技术检测P67phox、P22phox蛋白水平的表达；
6.用Western-Blot技术检测，随着蟾毒它灵浓度的增加和作用时间的延长，HL-60细胞MAPK信号通路中p-P38、p-JNK、p-ERK1/2、P38、JNK、ERK1/2蛋白水平的表达；
7.用Western-Blot技术检测不同浓度蟾毒它灵作用下，加入P38、JNK、ERK抑制剂（SB203580、SP600125、U0126）后，p-P38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白水平的表达；
8.用Western-Blot技术检测不同浓度蟾毒它灵作用下，加入氧化抑制剂（NAC）后，P67phox、P22phox蛋白水平的表达；
8.用Western-Blot技术检测不同浓度和不同时间蟾毒它灵作用下，PML-RaRa蛋白水平的表达情况；
9.用GraphPadprism5.0录入至少重复三次的数据并进行统计。
结果:
1.蟾毒它灵对急性髓系白血病HL-60细胞的抑制作用大于正常的人外周血B淋巴细胞的抑制作用，差异有统计学意义；
2.随着蟾毒它灵浓度的增加和时间的延长，诱导急性髓系白血病HL-60细胞凋亡的作用随之增加，差异有统计学意义；
3.随着蟾毒它灵浓度和时间的增加，HL-60细胞中Bax、Cleavedcaspase-9、Cleavedcaspase-8及Cleavedcaspase-3表达逐渐增加，Bcl-2蛋白水平的表达逐渐降低，差异有统计学意义；
4.随着蟾毒它灵浓度和时间的增加，HL-60细胞p-P38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达增加，P38、JNK、ERK1/2总水平无明显变化，差异有统计学意义；且加入P38抑制剂、JNK抑制剂和ERK1/2抑制剂后，p-P38、p-JNK及同组的Cleaved-caspase3表达明显降低，但p-ERK1/2及同组Cleaved-caspase3表达无明显变化，差异有统计学意义；
5.随着蟾毒它灵浓度的增加，HL-60细胞中活性氧（ROS）的表达增加，P67phox和P22phox的表达增加；然而，加入氧化抑制剂（NAC）后，P67phox和P22phox的表达降低，差异有统计学意义;
7.随着蟾毒它灵浓度和作用时间的增加，HL-60细胞中PML-RaRa表达逐渐降低。
结论:
1.随着浓度和时间的增加，蟾毒它灵抑制急性髓系白血病HL-60细胞的增殖的作用随之增强，且对正常人外周血B淋巴细胞影响较小；
2.随着浓度和时间的增加，蟾毒它灵诱导急性髓系白血病HL-60细胞的凋亡作用增加；
3.蟾毒它灵诱导HL-60细胞凋亡的主要机制是激活ROS/MAPK信号通路；
4.蟾毒它灵能抑制PML-RaRa基因的表达。