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萝卜抗真菌蛋白(Rs-AFPs)是一类富含半胱氨酸的碱性短肽，具有抗丝状真菌活性，是天然免疫体系中的重要效应分子。萝卜抗真菌蛋白能够保护种子的正常萌发以及保护植物组织免受病原菌的危害。由于Rs-AFP2具有特殊的三级结构，使它可以抑制真菌的生长而对人体，植物细胞没有伤害。因此，在农业实践生产中具有良好的应用前景。
本文通过调整天然Rs-AFP2基因序列，并构建原核和真核的重组表达载体，分别在大肠杆菌和毕赤酵母中表达具有抗真菌活性的Rs-AFP2；同时观察其抑菌情况，根据光学显微图片初步分析了抑菌机理，这些工作为今后进一步深入研究及其生物活性和作用机理奠定了基础。论文主要内容与结果如下：
1.用于不同表达目的的Rs-AFP2基因设计检索NCBI得到Rs-AFP2成熟序列，根据大肠杆菌和毕赤酵母遗传密码子的偏爱性等因素，设计出4条用于不同表达目的的Rs-AFP2序列：
1)在大肠杆菌中融合表达RP1序列(具有CNBr裂解位点)；
2)在大肠杆菌中融合表达RP2序列(具有酸裂解位点)；
3)在毕赤酵母中表达Rs-AFP2成熟序列RP3；
4)用于拮抗阳离子的Rs-AFP2改造序列Rp4(Val39-Arg39)。
2.萝卜抗真菌蛋白RP1、RP2基因在大肠杆菌中的融合表达构建pET-32a-RP1，pET-32a-RP2重组表达载体，采用CaCl2转化法将目的蛋白的基因转入大肠杆菌DH5a中，经PCR筛选，确认阳性克隆，测序确认基因序列。提取构建成功的载体PET-32a-RP1，pET-32a-RP2，转化大肠杆菌BL21，通过IPTG诱导表达融合蛋白。
3.大肠杆菌表达目的蛋白的条件优化采用单因素实验方法优化诱导表达条件，得出融合蛋白主要以可溶性形式存在大肠杆菌细胞质中，在37℃的条件下，采用LB培养基，IPTG为1mmol/L，Amp浓度为100gg/mL，250r/min培养4h，融合蛋白表达量可以得到有效提高；破碎细胞采用超声波裂解法；通过两种裂解方法的比较，得出溴化氰裂解融合蛋白较为有效。
4.大肠杆菌表达产物RP1、RP2含量测定和生物活性鉴定采用上述优化条件表达RP1、RP2，两者的表达量分别为130.37μg/mL,81.84μg/mL，通过测试指示菌的抑菌情况得到了表达产物对丝状真菌，辣椒炭疽菌，香蕉炭疽菌有明显的抑制作用，而对白色念珠菌，灵菌等非丝状真菌和细菌没有抑制作用，RP1对辣椒炭疽菌的MIC为12.51μg/mL、RP2为17.5gg/mL，RP1对香蕉炭疽菌的MIC分别为12.5gg/mL、RP2为15μg/mL。
5.酵母表达产物RP3、RP4含量测定和生物活性鉴定RP3、RP4在酵母中的表达量分别为45.384μg/mL，36.972g，g/mL，在培养基中无K+，Ca2+，Mg2+存在情况下，RP3的MIC分别为12.5μg/mL,RP4为10μg/mL，在有K+，Ca2+，Mg2+存在情况下RP3的MIC为30μg/mL，RP4为17.5μg/mL，一定程度上达到了提高Rs-AFP2对离子抗拮能力的目的。
6.通过显微观察初步确定抑菌类型通过400倍和450倍光学显微镜下观察Rs-AFP2对辣椒炭疽菌的作用，初步确定萝卜抗真菌蛋白抑菌特点属于第二种类型，即抑制菌丝体生长。