论文部分内容阅读
羊草是欧亚大陆东部禾本科多年生乡土草种资源，发掘其耐寒、抗旱和耐盐等基因资源对理解羊草的抗逆机理和农作物改良均具有十分重要的意义。本文以实验室羊草抗逆转录组测序数据为基础，克隆得到两个羊草未知功能MYB基因全长cDNA序列，并对未知功能基因的功能进行了比较系统的研究，取得如下重要结果: 1.羊草未知功能基因LcMYB2和LcMYB3的克隆 通过测序数据分析，筛选出4条受胁迫显著诱导的羊草未知功能MYB基因序列，定量RT-PCR验证结果表明，测序得到的这些未知功能基因Contig序列均受干旱、ABA及盐胁迫显著诱导。采用RACE方法获得了两个羊草未知功能基因全长cDNA序列，分别命名为LcMYB2(contig10947)和LcMYB3(Contig7342)。 2.羊草未知功能基因LcMYB2结构和功能分析 LcMYB2基因全长cDNA序列为1291 bp，ORF序列为1092 bp，编码363个氨基酸，推测编码蛋白质分子量为38.5 kDa，等电点为8.45。生物信息学分析表明，LcMYB2有一个信号肽和两个跨膜区，LcMYB2基因的氨基端存在SANT/MYB超家族及未知功能的DUF591结构域。在NCBI库中有22个分属不同物种的序列都与LcMYB2基因存在较高的序列同源性，LcMYB2与大麦预测蛋白(BAK02871.1)(94％)、二穗短柄草无特征蛋白(XP_003564624)(81％)的同源性较高，与双子叶拟南芥(NP_199550) MYB-like的同源性较低(43％)，LcMYB2及其同源基因的具体功能尚未验证。 LcMYB2基因在叶、叶鞘、茎、穗、根、根茎芽和根茎组织中均有表达，在叶和茎中表达较弱，具有一定的器官专一性。LcMYB2基因的逆境胁迫表达模式分析表明，其转录水平受到旱胁迫明显诱导，在8h达到峰值，在24 h受盐和冷胁迫明显诱导，ABA处理1h，则明显诱导其表达。 采用拟南芥根尖表皮细胞稳定表达系统，确定LcMYB2融合蛋白定位于细胞核。酵母单杂实验证明LcMYB2蛋白具有转录激活活性。 通过构建LcMYB2基因的过表达载体，并获得转基因拟南芥。胁迫抗性比较试验表明，转LcMYB2基因拟南芥明显提高了抗旱性，干旱条件下种子萌发率、根长、幼苗以及成株抗旱表型等数据都显著高于对照。干旱肋、迫下转基因拟南芥体内可溶性糖含量、脯氨酸含量都显著高于野生型拟南芥，过表达LcMYB2拟南芥细胞内MDA含量比野生型显著降低，SOD活性比野生型明显升高。在甘露醇胁迫处理条件下，转基因植株中胁迫响应标志基因MYB2、P5CS1、RD22、RD29B和ARF3的表达量高于野生型植株。 因此，LcMYB2基因属于转录因子基因，推测该基因胁迫条件下主要通过提高植物抗氧化能力，增加脯氨酸和可溶性糖含量，提高MYB2、P5CS1、RD22、RD29B和ARF3等胁迫相关基因的表达量，提高了转基因拟南芥的抗旱能力。 3.羊草未知功能基因LcMYB3的结构和功能分析 LcMYB3基因的全长cDNA序列为1254 bp，ORF序列为516 bp，编码172个氨基酸。生物信息学分析显示，LcMYB3基因编码氨基酸序列有信号肽，但不存在跨膜区，包含SANT结构域，预测亚细胞定位在细胞核。NCBI库中有24个分属不同物种的序列都与LcMYB3存在较高相似度，LcMYB3蛋白与乌拉尔图小麦推测蛋白同源性为96％，与二穗短柄草同源性为81％，与水稻同源性为77％，与拟南芥为47％，这些同源蛋白功能都未验证。 定量PCR分析表明，LcMYB3基因在羊草的在根和叶中表达量较高，茎、叶鞘和穗中的表达较低。LcMYB3基因可被低温、NaCl、甘露醇和ABA等非生物胁迫诱导，其中，低温处理12h表达量较高，NaCl和ABA处理在8h和12h基因表达量较高，甘露醇处理8h表达量较高。酵母单杂实验证明了LcMYB3蛋白具有转录激活活性。 构建了LcMYB3基因的过表达载体并获得转基因拟南芥，转LcMYB3基因拟南芥显著提高了冷胁迫下的种子萌发率和根长，提高了拟南芥的抗冷性。 综上所述，本研究克隆得到两个羊草胁迫相关未知功能MYB基因，并对其结构、生化功能、亚细胞定位以及生物学功能进行较为系统的研究。转LcMYB2基因拟南芥提高了抗干旱能力，而LcMYB3转基因拟南芥的抗性、生理和分子机制有待继续研究。 本试验以羊草为试验材料，利用分子生物学手段克隆了2个未知功能基因，初步揭示了羊草未知功能LcMYB2基因的生物学功能及作用机理，对培育抗逆优质牧草新品种，以及草原生态建设具有重要意义。