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鞘翅目(Coleoptera)是昆虫纲(Insecta)中最大的目，赤拟谷盗(Tribolium castaneum)作为鞘翅目重要的代表，被广泛用于发育学、进化生物学及免疫学的研究中，同时它又是一种重要的储粮害虫，严重影响储存粮食的品质。鉴于此，开展对赤拟谷盗抵抗病原体感染的免疫应答机制的研究，不仅能提高人们对无脊椎动物先天免疫的了解，而且可为防控储粮害虫提供理论基础。凝集素在病原识别和清除过程中发挥重要作用，目前昆虫C-型凝集素(C-type lectins,CTLs)和半乳糖苷结合凝集素(galactoside-binding lectins，Galectins)的研究主要集中在鳞翅目(Lepidoptera)与双翅目(Diptera)，如家蚕(Bombyx mori)、烟草天蛾(Manduca sexta)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)等，然而在鞘翅目昆虫赤拟谷盗中未见相关报道。为了阐明以上基因在赤拟谷盗先天免疫系统中的具体功能与作用机制，本研究以赤拟谷盗作为实验动物，探究了一种含两个碳水化合物识别结构域(C-type carbohydrate recognition domain，CRD)的免疫型凝集素(Immulectins， IML)TcCTL3、一种含单个CRD结构域的CTL-S型凝集素(TcCTL6)、一种含单个CRD结构域和几个其他结构域的CTL-X-型凝集素(TcCTL16)和一种含半乳糖凝集素结合结构域的GPCR受体Latrophilin(Lph)在宿主抗细菌先天免疫防御中的作用。本研究得到如下结果：
1.赤拟谷盗C型凝集素的结构特征及进化关系
我们已经在赤拟谷盗基因组中鉴定出17个CTLs基因，它们编码一到两个碳水化合物识别结构域(CRDs)的蛋白。CTL1、CTL2、CTL4到10和CTL13(属于CTL-S型)有一个CRD;CTL3(属于IML型)有两个CRDs;CTL11到17(CTL13除外，属于CTL-X型)有一个CRD和其他结构域。8种CTL-S型和一种IML型CTLs具有信号肽，可能属于分泌蛋白。3个CTL-X型CTLs同时具有N端信号肽和C端的跨膜区域，表明它们可能是膜锚定蛋白。系统发育分析表明，来自不同昆虫的CTL‐S、CTL‐X和IML型凝集素可以在至少六种鞘翅目/双翅目/鳞翅目/膜翅目昆虫中形成同源类群，提示它们在广泛的全变态昆虫中具有保守功能。基因鉴定、序列比较和系统发育分析为进一步研究赤拟谷盗CTLs奠定了坚实的基础。
2.IML型凝集素(TcCTL3)在赤拟谷盗先天免疫中的功能研究
我们克隆了赤拟谷盗中具有双CRD结构域的TcCTL3的开放阅读框，该蛋白在CRD1结构域中含有一个高度保守的WHD(Trp53-His54-Asp55)基序。研究发现在赤拟谷盗的时期分布中，除了早期卵以外，TcCTL3在其他所有发育阶段均高表达。组织分布结果显示TcCTL3主要分布于中枢神经系统和血淋巴中。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)和肽聚糖(Peptidoglycan, PGN)刺激后，TcCTL3的转录水平显著增加。另外，体外重组表达的TcCTL3能够直接结合LPS、PGN和所有被测试细菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌)，并在Ca2+存在的情况下诱导广谱的细菌凝集。进一步研究发现TcCTL3主要通过CRD1结构域参与对细菌的结合与凝集。当TcCTL3基因被干扰后，在LPS和PGN刺激下，显著降低了赤拟谷盗体内九种抗菌肽(AMPs)(att1、att2、att3、def1、def2、cole1、cole2、cecr2和cecr3)以及四个转录因子(TFs)(dif1、dif2、rel和jnk)的转录水平。与对照组相比，TcCTL3沉默后增加了细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)感染赤拟谷盗的死亡率。综上所述，TcCTL3可以通过模式识别、凝集和调控AMP表达介导赤拟谷盗的免疫反应。这些发现表明TcCTL3具有抵抗细菌的潜能，并为害虫防控提供了一种以RNA干扰技术为基础的分子靶标。
3.CTL-S型凝集素(TcCTL6)在赤拟谷盗先天免疫中的功能研究
在赤拟谷盗中鉴定出具有单CRD结构域的TcCTL6(TC003708)。TcCTL6包含一个654bp的开放阅读框，编码217个氨基酸。TcCTL6能被大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)显著诱导。结合实验表明，重组TcCTL6不仅能与LPS和PGN结合，而且在Ca2+存在的条件下也能结合革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌和绿脓杆菌)。此外，当TcCTL6被干扰后，四种抗菌肽(att1、att2、cole1和cole2)的转录水平明显下降。这些结果表明，TcCTL6可能通过调控AMPs的表达以及凝集入侵的细菌，在对病原体感染的免疫应答中起着至关重要的作用。
4.赤拟谷盗CTL-X型凝集素(TcCTL16)在细菌感染过程中的功能研究
TcCTL16包含一个CRD结构域、4个(complement control protein,CCP)结构域和一个跨膜结构域，属于赤拟谷盗CTL-X型凝集素。TcCTL16广泛分布在赤拟谷盗的不同组织，其中在血淋巴和神经系统尤为丰富。然而在受到LPS、PGN、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌刺激后TcCTL16表达水平显著上调，并且在Ca2+存在的情况下，能够结合金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌。赤拟谷盗TcCTL16被RNAi后，其转录因子rel被激活，同时IMD信号通路调控的AMP基因(att2，def1、def2、cole1、cole2、cecr2和cecr3)高表达。另外，TcCTL16被沉默后显著提高了赤拟谷盗在细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)感染后的存活率，这些结果表明TcCTL16可能通过负向调控IMD通路参与赤拟谷盗的先天免疫反应。
5.具有半乳糖凝集素结构域的蛛毒素受体(Lph)在赤拟谷盗先天免疫中的功能研究
Lph包含半乳糖凝集素结合结构域(Gal)、荷尔蒙受体结构域(HRM)、G蛋白偶联受体自溶诱导域(GAIN)、G蛋白偶联受体蛋白水解位点(GPS)和7次跨膜结构域(7tm)。在受到大肠杆菌或金黄色葡萄球菌刺激后，Lph、酚氧化酶原激活系统成员(Tryp1、SPI1和SPI2)的表达被显著激活。利用RNAi敲低Lph的表达会抑制Tryp1、SPI1、SPI2及抗菌肽(att1、att2、att3、def2、cole1和cole2)的表达。纯化的Lph胞外段重组蛋白(rLph-n)能够结合5种细菌但结合活性不同，其结合能力受LPS和PGN的竞争性抑制。纯化的Lph胞外段重组蛋白(rLph-n)和rGal结构域重组蛋白能够凝集以上5种细菌，且这种凝集活性依赖Ca2+。这些结果表明在赤拟谷盗的先天免疫应答中作为含Gal结构域的GPCR，Lph参与包括病原识别、诱导酚氧化酶原系统的活化以及调控抗菌肽的表达。这些结果为进一步研究机体对抗病原体入侵的先天免疫应答机制奠定了基础。
1.赤拟谷盗C型凝集素的结构特征及进化关系
我们已经在赤拟谷盗基因组中鉴定出17个CTLs基因，它们编码一到两个碳水化合物识别结构域(CRDs)的蛋白。CTL1、CTL2、CTL4到10和CTL13(属于CTL-S型)有一个CRD;CTL3(属于IML型)有两个CRDs;CTL11到17(CTL13除外，属于CTL-X型)有一个CRD和其他结构域。8种CTL-S型和一种IML型CTLs具有信号肽，可能属于分泌蛋白。3个CTL-X型CTLs同时具有N端信号肽和C端的跨膜区域，表明它们可能是膜锚定蛋白。系统发育分析表明，来自不同昆虫的CTL‐S、CTL‐X和IML型凝集素可以在至少六种鞘翅目/双翅目/鳞翅目/膜翅目昆虫中形成同源类群，提示它们在广泛的全变态昆虫中具有保守功能。基因鉴定、序列比较和系统发育分析为进一步研究赤拟谷盗CTLs奠定了坚实的基础。
2.IML型凝集素(TcCTL3)在赤拟谷盗先天免疫中的功能研究
我们克隆了赤拟谷盗中具有双CRD结构域的TcCTL3的开放阅读框，该蛋白在CRD1结构域中含有一个高度保守的WHD(Trp53-His54-Asp55)基序。研究发现在赤拟谷盗的时期分布中，除了早期卵以外，TcCTL3在其他所有发育阶段均高表达。组织分布结果显示TcCTL3主要分布于中枢神经系统和血淋巴中。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)和肽聚糖(Peptidoglycan, PGN)刺激后，TcCTL3的转录水平显著增加。另外，体外重组表达的TcCTL3能够直接结合LPS、PGN和所有被测试细菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌)，并在Ca2+存在的情况下诱导广谱的细菌凝集。进一步研究发现TcCTL3主要通过CRD1结构域参与对细菌的结合与凝集。当TcCTL3基因被干扰后，在LPS和PGN刺激下，显著降低了赤拟谷盗体内九种抗菌肽(AMPs)(att1、att2、att3、def1、def2、cole1、cole2、cecr2和cecr3)以及四个转录因子(TFs)(dif1、dif2、rel和jnk)的转录水平。与对照组相比，TcCTL3沉默后增加了细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)感染赤拟谷盗的死亡率。综上所述，TcCTL3可以通过模式识别、凝集和调控AMP表达介导赤拟谷盗的免疫反应。这些发现表明TcCTL3具有抵抗细菌的潜能，并为害虫防控提供了一种以RNA干扰技术为基础的分子靶标。
3.CTL-S型凝集素(TcCTL6)在赤拟谷盗先天免疫中的功能研究
在赤拟谷盗中鉴定出具有单CRD结构域的TcCTL6(TC003708)。TcCTL6包含一个654bp的开放阅读框，编码217个氨基酸。TcCTL6能被大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)显著诱导。结合实验表明，重组TcCTL6不仅能与LPS和PGN结合，而且在Ca2+存在的条件下也能结合革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌和绿脓杆菌)。此外，当TcCTL6被干扰后，四种抗菌肽(att1、att2、cole1和cole2)的转录水平明显下降。这些结果表明，TcCTL6可能通过调控AMPs的表达以及凝集入侵的细菌，在对病原体感染的免疫应答中起着至关重要的作用。
4.赤拟谷盗CTL-X型凝集素(TcCTL16)在细菌感染过程中的功能研究
TcCTL16包含一个CRD结构域、4个(complement control protein,CCP)结构域和一个跨膜结构域，属于赤拟谷盗CTL-X型凝集素。TcCTL16广泛分布在赤拟谷盗的不同组织，其中在血淋巴和神经系统尤为丰富。然而在受到LPS、PGN、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌刺激后TcCTL16表达水平显著上调，并且在Ca2+存在的情况下，能够结合金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌。赤拟谷盗TcCTL16被RNAi后，其转录因子rel被激活，同时IMD信号通路调控的AMP基因(att2，def1、def2、cole1、cole2、cecr2和cecr3)高表达。另外，TcCTL16被沉默后显著提高了赤拟谷盗在细菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)感染后的存活率，这些结果表明TcCTL16可能通过负向调控IMD通路参与赤拟谷盗的先天免疫反应。
5.具有半乳糖凝集素结构域的蛛毒素受体(Lph)在赤拟谷盗先天免疫中的功能研究
Lph包含半乳糖凝集素结合结构域(Gal)、荷尔蒙受体结构域(HRM)、G蛋白偶联受体自溶诱导域(GAIN)、G蛋白偶联受体蛋白水解位点(GPS)和7次跨膜结构域(7tm)。在受到大肠杆菌或金黄色葡萄球菌刺激后，Lph、酚氧化酶原激活系统成员(Tryp1、SPI1和SPI2)的表达被显著激活。利用RNAi敲低Lph的表达会抑制Tryp1、SPI1、SPI2及抗菌肽(att1、att2、att3、def2、cole1和cole2)的表达。纯化的Lph胞外段重组蛋白(rLph-n)能够结合5种细菌但结合活性不同，其结合能力受LPS和PGN的竞争性抑制。纯化的Lph胞外段重组蛋白(rLph-n)和rGal结构域重组蛋白能够凝集以上5种细菌，且这种凝集活性依赖Ca2+。这些结果表明在赤拟谷盗的先天免疫应答中作为含Gal结构域的GPCR，Lph参与包括病原识别、诱导酚氧化酶原系统的活化以及调控抗菌肽的表达。这些结果为进一步研究机体对抗病原体入侵的先天免疫应答机制奠定了基础。