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氟啶虫酰胺(flonicamid，FLO),一种新型低毒的吡啶酰胺类杀虫剂。氟啶虫胺腈(sulfoxaflor，SUL)，一种新型砜亚胺类杀虫剂。随着FLO和SUL的推广使用，其环境残留和环境毒性对生态系统产生了威胁。目前尚未有微生物降解FLO和SUL的研究报道。本文从土壤中筛选到两株具有较好的FLO降解能力的细菌JW2和PG13。经形态观察和16SrRNA基因序列分析，JW2被鉴定为氨基酸杆菌属Aminobacter并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，保藏号为CGMCC1.17253；PG13为粪产碱菌Alcaligenesfaecalis，保藏号为CGMCC17553。
Aminobactersp.CGMCC1.17253将FLO转化为其酰胺衍生物N-(4-三氟甲基烟酰)甘氨酰胺(N-(4-trifluoromethylnicotinoyl)glycinamide，TFNG-AM)。细胞浓度OD600为5的Aminobactersp.CGMCC1.17253的静息细胞在96h将起始浓度为904.7μmol/L的FLO降解至623.5μmol/L，降解率为31.1%，半衰期为7.4d。将Aminobactersp.CGMCC1.17253接种于含有80mg/kgFLO的土壤中，9d后的FLO降解率为72.6%，半衰期为4.8d。全基因组测序及基因注释分析显示Aminobactersp.CGMCC1.17253染色体上有一个钴离子型腈水合酶(nitrile hydratase, NHase, EC. 4.2.1.84)基因簇，分别编码α亚基，β亚基和激活蛋白。在EscherichiacoliRosetta中克隆Aminobactersp.CGMCC1.17253NHase基因。表达了NHase的E.coliRosetta具有FLO降解活性，降解产物为TFNG-AM。该结果表明Aminobactersp.CGMCC1.17253的NHase催化FLO水合为TFNG-AM。纯化Aminobactersp.CGMCC1.17253NHase并进行酶学特性测试，结果表明该酶催化FLO水合反应的最适温度为40℃，最适pH为7.0；底物特异性测试显示，该酶可以催化烟碱类杀虫剂啶虫脒、噻虫啉、植物激素前体3-吲哚乙腈、3-氰基吡啶和苯甲腈水合为其相应的酰胺衍生物，这一结果说明Aminobactersp.CGMCC1.17253NHase具有较广的底物谱。蛋白质三维同源性模型构建结果显示，Aminobactersp.CGMCC1.17253NHase的αCys-105、αCys-108、αCys-110和αSer-109为钴离子结合位点，βArg-52和βArg-150形成的氢键稳定了爪形结构，参与识别底物的βIle-48、βSer-51和βTrp-72形成疏水口袋。Aminobactersp.CGMCC1.17253可将SUL降解为其酰胺产物X11719474。细胞浓度OD600为5的Aminobactersp.CGMCC1.17253静息细胞在96h内将SUL从初始浓度703.3μmol/L降解为425.0μmol/L，降解率为39.6%，半衰期为5.5d。将Aminobactersp.CGMCC1.17253接种于含有80mg/kgSUL的土壤中，9d后SUL降解了59.1%，半衰期为7.0d。表达了Aminobactersp.CGMCC1.17253NHase的E.coliRosetta和NHase具有SUL降解活性。Aminobactersp.CGMCC1.17253通过NHase的水合作用将SUL降解为X11719474。
A.faecalisCGMCC17553将FLO降解为酰胺衍生物TFNG-AM和酸衍生物4-(三氟甲基)烟碱甘氨酸(4-(trifluoromethyl)nicotinol glycine，TFNG)两个产物。其细胞浓度OD600为5的静息细胞在96h可将起始浓度为915μmol/L的FLO降解至11μmol/L，降解率为98.8%，摩尔转化率为99.5%，FLO降解半衰期仅为15h。将A.faecalisCGMCC17553接种于含有80mg/kgFLO的土壤中，9d后的FLO降解率为72.6%，半衰期为3.3d。对A.faecalisCGMCC17553进行了全基因组测序，蛋白注释信息表明，A.faecalisCGMCC17553的基因组中不存在NHase编码基因，但有5个腈水解酶(nitrilase，EC 3.5.5.1)基因nitA、nitB、nitC，nitD和nitE。分别克隆这5个腈水解酶基因，构建pET28a表达质粒并转化至E.coliRosetta中，IPTG诱导腈水解酶异源表达。HPLC分析显示，表达了NitA的E.coliRosetta具有FLO降解活性，可以将FLO转化为TFNG和TFNG-AM两个产物；表达了NitD的E.coliRosetta也具有FLO降解活性，但产物只有TFNG-AM，不生成TFNG；而表达了NitB、NitC、NitE以及空质粒的E.coliRosetta均没有FLO降解活性。酶学特性分析显示，NitA最适温度为40℃，最适pH为7.0。NitD最适温度为40℃，最适pH为8.0。NitA和NitD对啶虫脒、噻虫啉、3-吲哚乙腈或3-氰基吡啶没有水解活性，表明NitA和NitD的底物特异性谱较窄。进一步对NitA、NitB、NitC，NitD和NitE进行了蛋白质三维结构模型构建，但其活性位点氨基酸残基的不同导致了其催化FLO降解的活性不同。
固氮菌草木樨箭菌EnsifermelilotiCGMCC7333对FLO和SUL具有降解活性，其NHase可分别催化FLO和SUL水合为TFNG-AM和X11719474。
综上所述，本文首次开展了微生物降解FLO和SUL的研究。分离到了两株FLO降解菌Aminobactersp.CGMCC1.17253和A.faecalisCGMCC17553。Aminobactersp.CGMCC1.17253和E.melilotiCGMCC7333通过NHase催化的水合途径将FLO降解为TFNG-AM；A.faecalisCGMCC17553通过NitA和NitD催化的水合途径将FLO降解为TFNG-AM，通过NitA催化的水解途径将FLO降解为TFNG；Aminobactersp.CGMCC1.17253和E.melilotiCGMCC7333通过NHase催化的水合途径将SUL降解为X11719474。本文研究结果有助于认识FLO和SUL的环境代谢和降解机制，同时有助于指导FLO和SUL生物修复剂的开发。
Aminobactersp.CGMCC1.17253将FLO转化为其酰胺衍生物N-(4-三氟甲基烟酰)甘氨酰胺(N-(4-trifluoromethylnicotinoyl)glycinamide，TFNG-AM)。细胞浓度OD600为5的Aminobactersp.CGMCC1.17253的静息细胞在96h将起始浓度为904.7μmol/L的FLO降解至623.5μmol/L，降解率为31.1%，半衰期为7.4d。将Aminobactersp.CGMCC1.17253接种于含有80mg/kgFLO的土壤中，9d后的FLO降解率为72.6%，半衰期为4.8d。全基因组测序及基因注释分析显示Aminobactersp.CGMCC1.17253染色体上有一个钴离子型腈水合酶(nitrile hydratase, NHase, EC. 4.2.1.84)基因簇，分别编码α亚基，β亚基和激活蛋白。在EscherichiacoliRosetta中克隆Aminobactersp.CGMCC1.17253NHase基因。表达了NHase的E.coliRosetta具有FLO降解活性，降解产物为TFNG-AM。该结果表明Aminobactersp.CGMCC1.17253的NHase催化FLO水合为TFNG-AM。纯化Aminobactersp.CGMCC1.17253NHase并进行酶学特性测试，结果表明该酶催化FLO水合反应的最适温度为40℃，最适pH为7.0；底物特异性测试显示，该酶可以催化烟碱类杀虫剂啶虫脒、噻虫啉、植物激素前体3-吲哚乙腈、3-氰基吡啶和苯甲腈水合为其相应的酰胺衍生物，这一结果说明Aminobactersp.CGMCC1.17253NHase具有较广的底物谱。蛋白质三维同源性模型构建结果显示，Aminobactersp.CGMCC1.17253NHase的αCys-105、αCys-108、αCys-110和αSer-109为钴离子结合位点，βArg-52和βArg-150形成的氢键稳定了爪形结构，参与识别底物的βIle-48、βSer-51和βTrp-72形成疏水口袋。Aminobactersp.CGMCC1.17253可将SUL降解为其酰胺产物X11719474。细胞浓度OD600为5的Aminobactersp.CGMCC1.17253静息细胞在96h内将SUL从初始浓度703.3μmol/L降解为425.0μmol/L，降解率为39.6%，半衰期为5.5d。将Aminobactersp.CGMCC1.17253接种于含有80mg/kgSUL的土壤中，9d后SUL降解了59.1%，半衰期为7.0d。表达了Aminobactersp.CGMCC1.17253NHase的E.coliRosetta和NHase具有SUL降解活性。Aminobactersp.CGMCC1.17253通过NHase的水合作用将SUL降解为X11719474。
A.faecalisCGMCC17553将FLO降解为酰胺衍生物TFNG-AM和酸衍生物4-(三氟甲基)烟碱甘氨酸(4-(trifluoromethyl)nicotinol glycine，TFNG)两个产物。其细胞浓度OD600为5的静息细胞在96h可将起始浓度为915μmol/L的FLO降解至11μmol/L，降解率为98.8%，摩尔转化率为99.5%，FLO降解半衰期仅为15h。将A.faecalisCGMCC17553接种于含有80mg/kgFLO的土壤中，9d后的FLO降解率为72.6%，半衰期为3.3d。对A.faecalisCGMCC17553进行了全基因组测序，蛋白注释信息表明，A.faecalisCGMCC17553的基因组中不存在NHase编码基因，但有5个腈水解酶(nitrilase，EC 3.5.5.1)基因nitA、nitB、nitC，nitD和nitE。分别克隆这5个腈水解酶基因，构建pET28a表达质粒并转化至E.coliRosetta中，IPTG诱导腈水解酶异源表达。HPLC分析显示，表达了NitA的E.coliRosetta具有FLO降解活性，可以将FLO转化为TFNG和TFNG-AM两个产物；表达了NitD的E.coliRosetta也具有FLO降解活性，但产物只有TFNG-AM，不生成TFNG；而表达了NitB、NitC、NitE以及空质粒的E.coliRosetta均没有FLO降解活性。酶学特性分析显示，NitA最适温度为40℃，最适pH为7.0。NitD最适温度为40℃，最适pH为8.0。NitA和NitD对啶虫脒、噻虫啉、3-吲哚乙腈或3-氰基吡啶没有水解活性，表明NitA和NitD的底物特异性谱较窄。进一步对NitA、NitB、NitC，NitD和NitE进行了蛋白质三维结构模型构建，但其活性位点氨基酸残基的不同导致了其催化FLO降解的活性不同。
固氮菌草木樨箭菌EnsifermelilotiCGMCC7333对FLO和SUL具有降解活性，其NHase可分别催化FLO和SUL水合为TFNG-AM和X11719474。
综上所述，本文首次开展了微生物降解FLO和SUL的研究。分离到了两株FLO降解菌Aminobactersp.CGMCC1.17253和A.faecalisCGMCC17553。Aminobactersp.CGMCC1.17253和E.melilotiCGMCC7333通过NHase催化的水合途径将FLO降解为TFNG-AM；A.faecalisCGMCC17553通过NitA和NitD催化的水合途径将FLO降解为TFNG-AM，通过NitA催化的水解途径将FLO降解为TFNG；Aminobactersp.CGMCC1.17253和E.melilotiCGMCC7333通过NHase催化的水合途径将SUL降解为X11719474。本文研究结果有助于认识FLO和SUL的环境代谢和降解机制，同时有助于指导FLO和SUL生物修复剂的开发。