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目的: 本研究拟在前期研究的基础上，观察“促愈熏洗方”对“混合痔”、“低位单纯性肛瘘”两类疾病患者术后创面的疗效，利用统计模型分析研究该复方在针对不同病种、不同稀释比例、不同熏洗时间、不同治疗时间等多因素交互作用下对促进创面愈合临床疗效的影响。同时以体外培养的人成纤维细胞为研究对象，分别加入不同浓度“促愈熏洗方”水提取物的不同部分，检测人成纤维细胞株(HFF-1)的增殖能力及其胶原蛋白的表达，探讨外用“促愈熏洗方”对创面愈合的作用机制。 方法: 1.“促愈熏洗方”对混合痔和低位单纯性肛瘘术后患者创面影响的临床观察 对121例混合痔术后患者及144例低位单纯性肛瘘术后患者使用不同稀释比例及不同熏洗时间的“促愈熏洗方”进行分组治疗。在术后3个时间节点（术后第3天、7天、14天）观察各组患者创面疼痛、水肿、渗出、出血等情况，并根据疗效判断四级加权评分法计算积分。通过重复测量非参数方法和多因素方差分析研究病种、熏洗液稀释比例、熏洗时间、疗程等因素对术后症状积分的影响。 2.“促愈熏洗方”对混合痔和低位单纯性肛瘘术后患者创面影响的作用机制研究 本研究中将“促愈熏洗方”的水提取物进行加工萃取，获得乙酸乙酯、水、正丁醇、石油醚四个萃取部分。以体外培养的HFF-1为研究对象，分别加入不同浓度的各萃取部分，采用CKK-8检测法、FCM、细胞划痕实验、ELISA法和WesternBlot法等方法检测HFF-1的增值能力及其胶原表达，探讨外用“促愈熏洗方”对创面愈合的作用机制。 (1)“促愈熏洗方”不同浓度水提取物对HFF-1的增殖能力的影响 分别用“促愈熏洗方”水提取物的乙酸乙酯、水、正丁醇萃取部分，各自以250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml5个药物浓度给药对数生长期的HFF-1，于24小时、48小时、72小时后采用CCK-8细胞增殖法检测其细胞存活率（空白对照）。 (2)“促愈熏洗方”不同浓度水提取物对HFF-1早期凋亡和晚期凋亡的影响分别用“促愈熏洗方”水提取物的乙酸乙酯、水、正丁醇萃取部分，各自以250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml5个药物浓度给药对数生长期的HFF-1，24小时后采用FCM方法检测早期凋亡和晚期凋亡的细胞数量（空白对照）。 (3)“促愈熏洗方”不同浓度水提取物对HFF-1迁移能力的影响 分别用“促愈熏洗方”水提取物的乙酸乙酯、水、正丁醇萃取部分，各自以62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml3个药物浓度给药对数生长期的HFF-1，采用细胞划痕实验检测0小时的细胞划痕宽度和24小时后的细胞迁移面积（空白对照） (4)“促愈熏洗方”不同浓度水提取物对HFF-1纤维结合蛋白(Fn)、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白表达的影响 分别用“促愈熏洗方”水提取物的乙酸乙酯、水、正丁醇萃取部分，各自以250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml5个药物浓度给药对数生长期的HFF-1，48小时后采用ELISA法和Western Blot免疫印记分析法检测HFF-1中纤维结合蛋白(Fn)、胶原蛋白（COLLI和COLLⅢ）的表达量（空白对照）。 结果: 1.“促愈熏洗方”对混合痔和低位单纯性肛瘘术后创面影响的临床观察结果 (1)本次临床研究进一步观察该药针对不同疾病、药液稀释比例、熏洗时间多个因素在术后第3天、7天、14天不同观察节点上对于术后创面临床表现的干预作用。试验显示:“促愈熏洗方”干预术后创面后，不论疾病类别、药液稀释比高低，还是熏洗时间长短，观察时间越长，创面表现较前一个时间节点都有明显的改善（P＜0.05）。 (2)根据不同疾病，针对不同的术后创面表现，选择使用“促愈熏洗方”的稀释比例、熏洗时间和疗程长短是不同的:①“促愈熏洗方”干预术后创面出血，混合痔术后患者的减轻程度始终较低位单纯性肛瘘术后患者的明显，与药液稀释比例、熏洗时间和治疗时间节点皆无明显相关性。②“促愈熏洗方”干预术后创面水肿，随着治疗时间节点延长，低位单纯性肛瘘术后患者较混合痔术后患者的减轻程度明显，与药液稀释比例和熏洗时间无明显相关性。③术后第7天发现:“促愈熏洗方”干预不同疾病术后创面的渗出情况，出现对于熏洗时间和药液稀释比例的双重依赖。对痔患者来说，高浓度长时间优于高浓度短时间;对肛瘘患者而言，低浓度长时间效果最佳。 (3)术后第7天和术后第14天比较，观察节点在7天，药液稀释比例和熏洗时间对于创面的症状影响有交互作用;观察节点延长到14天，两个相关因素对于创面的症状影响反而无交互作用。 2.“促愈熏洗方”对HFF-1及其表达蛋白的影响 (1)本研究将外用复方的水提取物进行加工萃取，获得四个萃取部分:乙酸乙酯部分、水部分、正丁醇部分、石油醚部分。由于石油醚部分量少且贴壁，难以取样，所以后续实验用其中的三个部位干预HFF-1，研究中药复方促进创面愈合的机制。 (2)乙酸乙酯萃取部分能够促进HFF-1的增殖，且与浓度和作用时间相关:浓度越高则对细胞增殖的抑制性越强;作用24h时可增强细胞的增殖能力，但是48h和72h时就发生增殖抑制。不能有效保护HFF-1免于早期凋亡和晚期凋亡。能提高24h细胞迁移能力，且随浓度呈坡形变化，迁移能力从高浓度开始随着浓度减低逐渐增强，到31.25μg/ml这个浓度时，迁移面积最大，随后随着浓度减低而逐渐减弱。乙酸乙酯萃取部分能够促使HFF-1合成和分泌COLLⅢ，使COLLⅢ上调表达，现有的研究并不能清楚阐明该部分对于细胞合成、分泌其他两种胶原蛋白的作用。 (3)水萃取部分能够促进HFF-1的增殖，但是作用72h，高浓度则对细胞增殖发生抑制;不能保护HFF-1免于早期凋亡，可以延缓HFF-1的晚期凋亡;能提高24h细胞迁移能力，且随浓度呈坡形变化，迁移能力从高浓度开始随着浓度减低逐渐增强，到31.25μg/ml这个浓度时，迁移面积最大，随后随着浓度减低而逐渐减弱。水萃取部分能够促进HFF-1合成和分泌COLLⅠ和Fn，使这两种胶原蛋白上调表达，而且在125μg/ml浓度时表达水平最高。而COLLⅢ在两种不同蛋白检测中表达不同，ELISA法提示各浓度药液均能上调COLLⅢ的表达，且高浓表达水平高;Western-Blot法则提示COLLⅢ没有明显的上调表达。 (4)正丁醇萃取部分作用24h时能促进HFF-1的增殖能力，48h时仅不高于31.25μg/ml浓度的该部分能促进HFF-1的增殖能力;该部分能够保护HFF-1免于早期凋亡和晚期凋亡，增加HFF-1的数量，以低浓度为优;能提高24h细胞迁移能力，且随浓度呈坡形变化，迁移能力从高浓度开始随着浓度减低逐渐增强，到31.25μg/ml这个浓度时，迁移面积最大，随后随着浓度减低而逐渐减弱。正丁醇萃取部分能够促进HFF-1合成和分泌COLLⅠ、COLLⅢ和Fn，使这三种胶原蛋白上调表达，但是高浓度时则会抑制HFF-1合成和分泌胶原蛋白，中低浓度能使胶原蛋白的表达水平处于较高位置。 结论: 1.外用“促愈熏洗方”在临床对于促进肛肠疾病术后创面的愈合是有确定疗效的。在临床运用上有以下几个特点: (1)基于杨巍教授外用经验方“促愈熏洗方”在前期临床研究，表明本复方与阳性对照药“痔疾洗液”相比，疗效更好。本次临床研究显示“促愈熏洗方”干预术后创面后，创面症状后一个时间节点较前一个时间节点都有显著改善。 (2)根据不同疾病，针对不同的术后创面表现，选择使用“促愈熏洗方”的稀释比例、熏洗时间和疗程长短是不同的。本方对于痔术后出血的治疗作用优于肛瘘;在针对术后创面水肿的影响上，本方以肛瘘为佳;在术后第7天时，对痔患者来说，高浓度长时间优于高浓度短时间;对肛瘘患者而言，低浓度长时间效果最佳。 (3)“促愈熏洗方”对于术后创面临床表现的干预时间宜早，即手术后尽早使用本方熏洗;时间不宜使用过久，治疗7天可能效果最佳。 2.外用“促愈熏洗方”对创面愈合的作用机制在于: (1)从细胞增值能力来看，复方的三个不同的萃取部分都能促进HFF-1的增殖，皆以作用24h时不出现增殖抑制。 (2)从24h细胞迁移能力来看，复方的三个不同的萃取部分都能提高HFF-1的迁移能力，扩大迁移面积，且随浓度呈坡形变化，迁移能力从高浓度开始随着浓度减低逐渐增强，到31.25μg/ml这个浓度时，迁移面积最大，随后随着浓度减低而逐渐减弱。 (3)从凋亡情况来看，三个不同的萃取部分只有正丁醇部分在低浓度时可以减少早期和晚期凋亡的细胞数量。 (4)此外，从HFF-1合成和分泌胶原蛋白能力来看，水萃取部分和正丁醇萃取部分都能促进HFF-1表达COLLⅠ;乙酸乙酯萃取部分能促进HFF-1较好表达COLLⅢ;水萃取部分和正丁醇萃取部分能促进HFF-1较好表达Fn。