论文部分内容阅读
小麦（Triticum aestivum）作为全球最重要的粮食作物之一，在全世界粮食消费中，以及我国粮食安全体系中都具有举足轻重的地位。长期以来，由于小麦基因组的庞大及复杂性，同时又缺乏高质量的参考序列等诸多问题，严重制约了小麦功能基因组学的发展。因此，获取合适的研究材料，发掘优异基因并对其基因功能进行深入研究，成了育种工作者的当务之急。而育种改良材料的获取及基因功能的研究和分析，最直接有效的方式便是从研究突变体着手。因此构建丰富的突变体库，就成了研究基因功能以及筛选育种好材料的重要环节。
目前常用的突变体库构建技术，主要是T-DNA插入法和Ac/Ds转座系统。T-DNA插入法操作简单，但在整合的过程中会产生序列缺失及串联重复等现象，且需要大量的组培工作，影响了后续的分子分析工作。Ac/Ds转座系统由于组培工作量小，随机插入及表型稳定遗传等优势，已经成为了构建突变体库的首选方法，在众多的植物中得到应用。鉴于小麦基因组的复杂性，而模式植物二穗短柄草（Brachypodium distachyon）与小麦亲缘关系比较近，同时又有拟南芥（Arabidopsis thaliana）的诸多优点（基因组小、生长周期短及生长条件简单等）。因此，本文首先将异源的Ac/Ds转座体系导入二穗短柄草中进行了较为深入的研究，随后又将该转座体系稍加改造，应用到了小麦中进行了初步研究。以期获得小麦与二穗短柄草的插入突变体库，主要结果如下：
（1）将异源Ac/Ds转座系统pSQ5通过农杆菌介导法导入二穗短柄草中，经过连续4代的循环筛选，共获得仅含Ds元件的稳定植株3185株。另外，将该转座体系稍加改造后导入小麦中，获得了稳定的仅含Ds元件的植株226株。通过Multiple-PCR及GUS染色等技术，证明了异源转座体系可以在二穗短柄草和小麦中工作。
（2）转座频率及分布特点。Ds转座子在二穗短柄草中的平均转座频率为6.7%，在小麦中为7.7%。经过Inverse-PCR对Ds元件的侧翼序列定位后，共获得了3057条有效序列，特异插入位点共有2301个，其中507个插入到外显子中，241个插入到内含子中，152个插入到5′UTR中，127个插入到3′UTR中，基因临近区域603条，671个插入到基因间隔区，插入到基因内部或者临近基因区的占总数的71%。说明Ds元件倾向于插入到基因内部或基因邻近区域，这对于构建插入突变体库大有裨益。由于小麦全基因组测序尚未完成，所以本文经过同样的技术获得的侧翼序列，进行网上在线BLAST后，发现仅有不足50%能够成功比对上（Mapping成功）。比对不上的序列设计了相关引物，分多批进行再次扩增后验证，证实比对不成功的序列，90%多是真实有效的。最终仅有7%的序列扩增不到，说明小麦序列gap仍很多。
（3）转座子插入特点。通过对2301个特异位点分析，发现在全基因组水平上，Ds转座子倾向于插入到染色体两端，而着丝粒区分布较少，另外，插入位点的数量与染色体大小呈正相关，并且Ds转座子的密集程度与染色体自身的基因密度成正相关。
（4）转座子倾向于连锁转座。随机抽取子代较多的4个系进行研究，其中＃E81有227个子代，＃F84有134个子代，＃B54有103个子代，＃H87有46个子代，另外，＃E81，＃F84及＃B54株系的初始插入位点（供体位点）在1号染色体上，＃H87在2号染色体上。经过NCBI及JGI在线BLAST以后，发现：除＃F84子代分布稍有偏差外，其他系别的子代中，全部倾向于插入到与供体位点相同的染色体上，插入比例分别是＃B54株系为44.7%，＃E81株系为47.6%，＃H87株系为43.5%，而＃F84株系为29.1%（插入位点最多为3号染色体，占比35.%）。进一步对初始插入点在1号染色体的3个株系进行分析，发现在30M长度处，有插入热点。
（5）转座发生的时间。通过GUS染色（按发育时间：4-5叶期，抽穗期，灌浆期随机取样，共5批，每批至少10株，含根、茎、叶及幼种各部分）、普通PCR及多重PCR的验证，证实在二穗短柄草和小麦中，Ds转座发生的时间，主要是在植株发育的后期，集中在开花到种子灌浆这一时期。
（6）小麦中的转座。为了研究异源转座体系在小麦中具体的工作情况，将Ac和Ds构建在不同T-DNA上的双元转座系统分别导入到小麦Fielder品种中，29个杂交组合共产生同时含有Ac和Ds元件的F1株系139个。随机取F1后代，总共研究了142个F2株系，发生转座的株系共计49个，占34.5%。研究的F2代植株共计2283棵，获得仅含Ds植株175棵，占总数的7.7%。在已发生转座的株系中，同一杂交亲本下不同F2代的转座频率存在较大的差异，该差异可能由Ds元件转座的时期不同所致。同一Ac，不同Ds的亲本组合，子代的转座频率差异较大，证明Ds的初始位置对转座频率有较大影响。同一Ds，不同Ac的亲本组合，其子代的转座频率仅有个别株系差异较大，经过不同的检验方法证明，不同表达量的AcTPase基因，其子代的转座频率差异不大，再次表明，对转座频率有较大影响的是Ds元件的初始位置。
（7）特异启动子控制Ac/Ds转座体系的构建。由于体细胞转座不能稳定遗传，加大了不必要的工作量。因此，为了减少该过程带来的困扰，提高工作效率，构建了生殖细胞特异启动子控制的Ac/Ds转座系统。花粉特异启动子选用的是番茄LAT52基因的启动子，构建成功的载体名称为pHAD1；卵细胞特异启动子选用的是拟南芥Ec1.2的启动子，载体名称为pOXQ1。并同时构建了对应特异启动子控制GUS的载体，分别命名为pHG（花粉特异）和pLG（卵细胞特异）。通过农杆菌介导的遗传转化方法，将构建成功的载体分别导入二穗短柄草中，共计获得组培苗136棵，其中pHG为65棵，pLG为21棵，pHAD1为22棵，pOXQ1为28棵。通过GUS染色，多重PCR及EDS-PCR证实，特异启动子控制的Ac/Ds转座系统能够在二穗短柄草中成功转座。
（8）二穗短柄草的杂交。为了诱导特定的目的基因，同时也为了解Ds转座子与目的基因的关系，验证其连锁转座的特点，本文随机挑选了部分仅含Ac元件的株系，并挑选了部分已知具体插入位点的仅含Ds元件的株系，进行了二穗短柄草的杂交（相关工作未见报道），总结了该方法的操作要领，其中，授粉时期的选择，去雄和授粉的操作方法，以及杂交后种子发育过程中的保湿是整个杂交过程的关键。本文对各个操作过程进行了较为详细的描述。
目前常用的突变体库构建技术，主要是T-DNA插入法和Ac/Ds转座系统。T-DNA插入法操作简单，但在整合的过程中会产生序列缺失及串联重复等现象，且需要大量的组培工作，影响了后续的分子分析工作。Ac/Ds转座系统由于组培工作量小，随机插入及表型稳定遗传等优势，已经成为了构建突变体库的首选方法，在众多的植物中得到应用。鉴于小麦基因组的复杂性，而模式植物二穗短柄草（Brachypodium distachyon）与小麦亲缘关系比较近，同时又有拟南芥（Arabidopsis thaliana）的诸多优点（基因组小、生长周期短及生长条件简单等）。因此，本文首先将异源的Ac/Ds转座体系导入二穗短柄草中进行了较为深入的研究，随后又将该转座体系稍加改造，应用到了小麦中进行了初步研究。以期获得小麦与二穗短柄草的插入突变体库，主要结果如下：
（1）将异源Ac/Ds转座系统pSQ5通过农杆菌介导法导入二穗短柄草中，经过连续4代的循环筛选，共获得仅含Ds元件的稳定植株3185株。另外，将该转座体系稍加改造后导入小麦中，获得了稳定的仅含Ds元件的植株226株。通过Multiple-PCR及GUS染色等技术，证明了异源转座体系可以在二穗短柄草和小麦中工作。
（2）转座频率及分布特点。Ds转座子在二穗短柄草中的平均转座频率为6.7%，在小麦中为7.7%。经过Inverse-PCR对Ds元件的侧翼序列定位后，共获得了3057条有效序列，特异插入位点共有2301个，其中507个插入到外显子中，241个插入到内含子中，152个插入到5′UTR中，127个插入到3′UTR中，基因临近区域603条，671个插入到基因间隔区，插入到基因内部或者临近基因区的占总数的71%。说明Ds元件倾向于插入到基因内部或基因邻近区域，这对于构建插入突变体库大有裨益。由于小麦全基因组测序尚未完成，所以本文经过同样的技术获得的侧翼序列，进行网上在线BLAST后，发现仅有不足50%能够成功比对上（Mapping成功）。比对不上的序列设计了相关引物，分多批进行再次扩增后验证，证实比对不成功的序列，90%多是真实有效的。最终仅有7%的序列扩增不到，说明小麦序列gap仍很多。
（3）转座子插入特点。通过对2301个特异位点分析，发现在全基因组水平上，Ds转座子倾向于插入到染色体两端，而着丝粒区分布较少，另外，插入位点的数量与染色体大小呈正相关，并且Ds转座子的密集程度与染色体自身的基因密度成正相关。
（4）转座子倾向于连锁转座。随机抽取子代较多的4个系进行研究，其中＃E81有227个子代，＃F84有134个子代，＃B54有103个子代，＃H87有46个子代，另外，＃E81，＃F84及＃B54株系的初始插入位点（供体位点）在1号染色体上，＃H87在2号染色体上。经过NCBI及JGI在线BLAST以后，发现：除＃F84子代分布稍有偏差外，其他系别的子代中，全部倾向于插入到与供体位点相同的染色体上，插入比例分别是＃B54株系为44.7%，＃E81株系为47.6%，＃H87株系为43.5%，而＃F84株系为29.1%（插入位点最多为3号染色体，占比35.%）。进一步对初始插入点在1号染色体的3个株系进行分析，发现在30M长度处，有插入热点。
（5）转座发生的时间。通过GUS染色（按发育时间：4-5叶期，抽穗期，灌浆期随机取样，共5批，每批至少10株，含根、茎、叶及幼种各部分）、普通PCR及多重PCR的验证，证实在二穗短柄草和小麦中，Ds转座发生的时间，主要是在植株发育的后期，集中在开花到种子灌浆这一时期。
（6）小麦中的转座。为了研究异源转座体系在小麦中具体的工作情况，将Ac和Ds构建在不同T-DNA上的双元转座系统分别导入到小麦Fielder品种中，29个杂交组合共产生同时含有Ac和Ds元件的F1株系139个。随机取F1后代，总共研究了142个F2株系，发生转座的株系共计49个，占34.5%。研究的F2代植株共计2283棵，获得仅含Ds植株175棵，占总数的7.7%。在已发生转座的株系中，同一杂交亲本下不同F2代的转座频率存在较大的差异，该差异可能由Ds元件转座的时期不同所致。同一Ac，不同Ds的亲本组合，子代的转座频率差异较大，证明Ds的初始位置对转座频率有较大影响。同一Ds，不同Ac的亲本组合，其子代的转座频率仅有个别株系差异较大，经过不同的检验方法证明，不同表达量的AcTPase基因，其子代的转座频率差异不大，再次表明，对转座频率有较大影响的是Ds元件的初始位置。
（7）特异启动子控制Ac/Ds转座体系的构建。由于体细胞转座不能稳定遗传，加大了不必要的工作量。因此，为了减少该过程带来的困扰，提高工作效率，构建了生殖细胞特异启动子控制的Ac/Ds转座系统。花粉特异启动子选用的是番茄LAT52基因的启动子，构建成功的载体名称为pHAD1；卵细胞特异启动子选用的是拟南芥Ec1.2的启动子，载体名称为pOXQ1。并同时构建了对应特异启动子控制GUS的载体，分别命名为pHG（花粉特异）和pLG（卵细胞特异）。通过农杆菌介导的遗传转化方法，将构建成功的载体分别导入二穗短柄草中，共计获得组培苗136棵，其中pHG为65棵，pLG为21棵，pHAD1为22棵，pOXQ1为28棵。通过GUS染色，多重PCR及EDS-PCR证实，特异启动子控制的Ac/Ds转座系统能够在二穗短柄草中成功转座。
（8）二穗短柄草的杂交。为了诱导特定的目的基因，同时也为了解Ds转座子与目的基因的关系，验证其连锁转座的特点，本文随机挑选了部分仅含Ac元件的株系，并挑选了部分已知具体插入位点的仅含Ds元件的株系，进行了二穗短柄草的杂交（相关工作未见报道），总结了该方法的操作要领，其中，授粉时期的选择，去雄和授粉的操作方法，以及杂交后种子发育过程中的保湿是整个杂交过程的关键。本文对各个操作过程进行了较为详细的描述。