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表面蜡质层是植物自我防护的屏障,在植物生长发育、减少非气孔水分蒸腾、提高耐旱性、减弱紫外光的伤害以及抵御病虫害侵袭等方面均起重要作用。深入理解植物叶表面蜡质的生理生化特点对于植物生物学研究具有非常重要的价值。 利用化学诱变剂MNU(N-Methyl-N-nitrosourea)处理水稻受精卵的方法,获得了一系列水稻叶表皮蜡质缺失(dripping-wet leaf, drp)突变体。本研究选取drp3突变体,其表型为叶片遇水后沾水,扫描电镜分析发现与野生型相比,突变体叶表皮蜡质晶体的密度显著降低,透射电镜结果表明突变体角质层的亚显微结构发生改变,其角质层表面多了一层透明蜡质层,整体厚度增加。生理分析和干旱胁迫实验进一步表明drp3叶片渗透性和失水率降低,植株变得更加耐旱。叶表面蜡质成分分析表明,突变体蜡质总量并未发生明显变化,但其超长链烷烃的含量明显高于野生型,该蜡质基因可能与超长链烷烃的代谢直接相关。 通过图位克隆方法分离到DRP3基因,该基因编码CYP96B亚家族的一个细胞色素P450酶,其拟南芥同源蛋白MAH1催化C29烷烃生成二级醇和酮类。序列分析结果发现G到A的突变引起了细胞色素P450保守结构域亚铁血红素结合环中氨基酸残基的突变,导致表型的突变。互补和抑制表达实验证实了DRP3基因就是目标基因。 RT-PCR和Real-time PCR结果表明DRP3在根、茎、叶、叶鞘和穗中均有表达,在叶片和叶鞘中表达量相对其他组织较高。转DRP3promoter: GUS植株GUS染色表明,该基因在各种组织中表达量都很低,各组织均未检测到明确信号。水稻叶原生质体结果表明DRP3定位于内质网。 在水稻中过量表达该基因发现,水稻植株的C29烷烃显著降低,C29一级醇显著升高;在拟南芥过量表达水稻DRP3基因,发现C29烷烃极显著降低,一级醇升高了约5倍,C29二级醇降低。拟南芥mah1-2突变体中异源表达水稻DRP3基因发现发现C29烷烃极显著降低,一级醇升高了约5倍,C29二级醇显著降低和C29酮类也降低。烟草瞬时转化实验表明,在底物和菌液混合注射下,C29一级醇显著升高。因此,在水稻、拟南芥和烟草中均能检测到C29烷烃降低,C29一级醇升高。上述结果表明DRP3可以催化C29烷烃生成C29一级醇。