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水稻矮化突变体对于阐明水稻生长发育调控的机理起着非常重要的作用,矮化的特性也被广泛应用于育种实践中;水稻种(亚种)间杂种具有强大的杂种优势,但是杂种不育限制了该优势的有效利用。因此,分离克隆矮化基因和杂种花粉不育基因,从分子水平阐明水稻矮化和杂种花粉不育的作用机理,对于指导水稻育种具有非常重要的理论和实践意义。
本论文包括两个部分的内容,其一是对一个从水稻幼穗反义cDNA文库转化中花11的T0代群体中获得的矮化突变体Z110-6进行遗传学分析,并对其突变位点进行了初步定位,为矮化基因的图位克隆奠定了基础;其二是对杂种不育S20基因进行了精细定位,以及对定位区段内的基因进行了遴选,并正在对目的候选基因进行功能互补实验。
对水稻矮化突变体Z110-6的分子遗传学分析,主要取得了以下结果:
1)通过TAIL-PCR扩出T-DNA插入位点旁邻序列,并对T-DNA插入点基因进行功能分析,结果表明,T-DNA插入不是导致矮化的原因。
2)本研究发现Z110-6矮化不抽穗突变是温度敏感型突变体,在正常条件下,表现为矮化不抽穗表型,而在高温条件下,则会变高且抽穗,它的雄配子完全败育,而雌配子部分可育。通过遗传学分析表明,Z110-6矮化突变体在与中花11杂交后代中,矮化突变表现为显性,而Z110-6矮化突变体与ZS97B的杂交组合中,矮化突变表现为隐性,而且是由两个隐性位点控制的。进一步利用分子标记遗传图谱法,找到了控制矮化突变的两个位点,分别在第1号染色体的长臂上和10染色体的短臂上,并且将10号染色体位点定位于定于标记A01560和A02170之间,物理距离大约610kb。
3)利用Affymetrix全基因组表达谱芯片,考察了Z110-6幼穗的基因表达谱,与正常同时期的中花11的基因表达谱相比,发现有819个基因是下调表达的,2626个基因是上调表达的。
对水稻亚非杂种不育基因S20的图位克隆,主要取得以下结果:
4)通过对定位材料的遗传分析,表明S20的花粉半不育由一个基因座的控制,符合单座位的孢子体.配子体互作的配子不育遗传模式。
5)以云南粳型品种(1550)及S20近等基因系1573和武运粳7号(95-22)及S20近等基因系SG42为材料,总共构建了11200株F2分离群体,用新开发的分子标记将杂种不育基因S20精细定位于分子标记350.2和367之间。并结合数据库公布水稻序列信息,构建了覆盖S20座位的物理图谱,将该座位定位于第七号染色体的BAC克隆B1317D11上约17kb范围内。
6)根据RGP和NCBI的基因预测结果,在精细定位区段内发现4个开放阅读框(ORFs),即ORF13、ORF15、ORF16和ORF17。通过RT-PCR对这四个基因表达特性分析,结果表明,只有ORF13在花药表达,据此推测ORF13为唯一可能的候选目的基因,该基因编码糖转运蛋白C(putative sugar carrier protein C)。
7)比较测序分析发现,两亲本武运粳7号(95-22)和S20近等基因系SG42的ORF13编码区及其上游调控区有很大差异,包括碱基插入、缺失和替换。在蛋白水平两亲本差异不大,95-22的ORF13编码518氨基酸的多肽,含有糖转运蛋白的功能域,与SG42的ORF13相比只有3个氨基酸的改变和一个氨基酸的缺失。
8)利用RT-PCR和基因芯片的ORF13表达分析表明,ORF13在根、茎和叶部均有较高水平的表达,而在花药的表达比较低。ORF13在95-22和SG42之间的表达水平没有明显的差异。
9)构建了ORF13的超表达载体、反义载体和互转载体,正在遗传转化中。
本研究结果对于阐明水稻生长发育调控的机理和水稻种间生殖隔离的分子机制奠定了坚实的基础。