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目的:建立一种半定量检测人巨噬细胞分泌的诱导性一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的微板酶联夹心杂交技术,此技术具有灵敏高、特异性好、操作简便,精密度高的特点,并探讨脂多糖(LPS)对人巨噬细胞(Mφ)iNOS-mRNA基因表达的影响.方法:(1)据Database(Ogawa,Y.,et al.1999)的iNOS-mRNA序列,用Primer premier5.0软件设计一对特异的引物;同时设计两条特异性探针,可分别与引物扩增区内的相应序列互补.(2)从血库中获得新鲜的人外周血,用淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞,将单个核细胞按2×10<6>~4×10<6>/ml的细胞数接种在6孔板上培养2小时,2小时后洗去未贴壁细胞,板上贴壁的为巨噬细胞,然后分别用不同浓度LPS(0μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,50μg/ml)刺激巨噬细胞24h以及用10μg/mlLPS刺激巨噬细胞不同时间(3h,6h,12h,20h,24h),观察LPS对人巨噬细胞iNOS-mRNA表达的影响.(3)用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取经刺激培养的人巨噬细胞总RNA,经逆转录反应(RT)获得对应于iNOS-mRNA的单链cDNA,此单链cDNA经过聚合酶反应(PCR)获得扩增的双链DNA片断,将扩增产物变性,加至已包被捕获探针的微孔板中,并加入检测探针与已结合的产物杂交,最后加入新和素—辣根过氧化物酶(Avidin—HRP)显色系统催化底物显色,450nm波长下检测吸光度.结论:该文建立的RT-PCR-微板酶联夹心杂交具有灵敏、特异、简单易操作,结果数据化等优点,能有效地检测出机体受到各种免疫刺激情况下人巨噬细胞iNOS-mRNA表达水平的变化.LPS是iNOS的强效诱导物,可在转录水平上诱导人巨噬细胞iNOS-mRNA的表达,其作用强度与LPS剂量(0μg/ml-50μg/ml的范围内)以及LPS刺激时间(0h,3h,6h,12h,20h,24h)有关.