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研究背景与目的:洁净良好的禽舍环境是家禽健康生长的重要前提和保障。随着集约化、标准化程度的不断提高,现代家禽舍多采用自动上料清粪、自动控温控湿控风的层叠式笼养模式。但是,由于饲养密度高、笼器具密集,舍内温湿度和通风量不均匀,各类粉尘、有害气体、微生物及代谢产物等形成的气溶胶浓度随家禽日龄增加而增加,对家禽和饲养人员的健康造成极大的威胁。过高浓度的PM2.5损伤呼吸系统后引起的宿主免疫功能受损可能引起细菌性继发感染,使机体产生更强烈的炎症反应,加重肺部损伤。本研究主要探究不同养殖周期禽舍内PM2.5的微生物组成结构的差异,并进一步研究PM2.5与绿脓杆菌协同诱导呼吸系统炎症损伤及相关分子机制。研究方法:对肉鸡不同生长阶段(3日龄、22日龄和40日龄)禽舍中的颗粒物(PM2.5)样本进行采集,通过扫描电镜观察颗粒物的形态差异进行观察,并对禽舍微生物气溶胶利用16S r DNA序列分析技术,对样本中细菌的多样性和相对丰度进行表征。其次,分别通过体外实验和体内实验探究未灭活PM2.5、灭活PM2.5(PM2.5~—)与绿脓杆菌的协同致炎效果。(1)PM2.5对RAW264.7细胞增殖的影响利用不同浓度的PM2.5和PM2.5~—(终浓度分别为1.00、0.50、0.25mg/ml)对RAW264.7细胞刺激24h,通过检测各组吸光度的变化,分析样品对细胞增殖情况的影响。(2)PM2.5对RAW264.7细胞NO表达量的影响利用不同浓度的PM2.5和PM2.5~—(终浓度分别为1.00、0.50、0.25mg/ml)对RAW264.7细胞刺激6h,使用Griess法检测各组细胞产生NO的情况。(3)PM2.5与绿脓杆菌对RAW264.7细胞炎症因子(IL-6、IL-8和TNF-α)表达的影响实验分为6组:正常对照组(PBS)、PM2.5未灭活组(PM2.5)、PM2.5灭活组(PM2.5~—)、PAO1组(PA)、PM2.5未灭活+PA组(PM2.5+PA)、PM2.5灭活+PA组(PM2.5~—+PA),其中PM2.5组和PM2.5~—组样品终浓度为1mg/ml,PA与细胞的侵染比(MOI)为10:1。样品加入刺激6h后,ELISA法检测IL-6、IL-8和TNF-α的表达情况。(4)PM2.5与绿脓杆菌对RAW264.7细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响实验分组如(3),样品刺激30min后,利用Western-blot技术检测各组细胞中NF-κB p65蛋白和phospo-NF-κB p65蛋白水平的表达情况。(5)PM2.5与绿脓杆菌对小鼠炎症反应的影响将60只雄性SPF级6周龄C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为6组,每组10只。实验分组如(3),其中PM2.5组和PM2.5~—组样品终浓度为1mg/ml,PA的浓度为1×10~8CFU/ml。每天对小鼠进行2次滴鼻处理,每次20μl,两次滴鼻的时间间隔为4h,进行肺部炎症模型的建立。分别于造模开始前、造模进行7天及14天时对小鼠进行体重称量并观察其活动状态。实验进行14天,造模结束后处死小鼠。HE染色和Masson染色观察肺组织病理变化;提取肺组织总RNA,实时荧光定量PCR检测进行IL-6、IL-8和TNF-α的表达;ELISA法检测小鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α的表达;Western-blot技术检测各组小鼠肺组织中NF-κB p65蛋白和phospo-NF-κB p65蛋白水平的表达情况。研究结果:(1)扫描电镜观察发现PM2.5的气溶胶粒子形态复杂多样,形态主要以丝状、类球形、团状、不规则形等形态存在,粒子形态复杂。(2)禽舍内PM2.5的浓度变化趋势与肉鸡日龄呈正相关。16S rDNA测序结果发现在禽舍内PM2.5中检测到了多种潜在的致病菌,主要有Acinetobacter(21.21%),Brevundimonas(6.88%),Cryptococcus(6.56%),Pseudomonas(2.94%)和Faecalibacterium(2.91%)等。(3)细胞增殖抑制与NO表达:样本浓度为1mg/ml时,与对照组(0.1718±0.02342)相比,PM2.5组(0.9337±0.03651)可显著性抑制RAW264.7细胞的增殖(P<0.001),且其抑制细胞增殖的效果显著高于PM2.5~—组(0.7788±0.02933,P<0.05);样本浓度为1mg/ml时,PM2.5可使RAW264.7细胞内NO表达水平升高(PM2.5组为55.21±1.678;对照组为1.97±1.034,P<0.001),且PM2.5组NO表达水平显著高于PM2.5~—组(21.97±0.8702,P<0.001)。(4)RAW264.7细胞分泌炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α及NF-κB p65及phospho-NF-κB p65蛋白的表达:PM2.5+PA组促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的表达量(8.022±0.6328,308.7±20.27,1287±56.46)显著高于对照组(32.14±3.269,P<0.01;62.43±8.848,P<0.01;795.7±28.64,P<0.01);PM2.5+PA组phospho-NF-κB p65/NF-κB p65的水平(0.03769±0.007571)均显著高于对照组(0.0918±0.002178,P<0.001)。(5)小鼠病理变化:对照组小鼠活泼好动,被毛光滑乌亮,食欲良好,动作灵敏迅速,呼吸均匀,对外界刺激反应灵敏;PM2.5+PA组小鼠状态最差,该组小鼠行动迟缓,被毛干燥暗黄,呼吸频率急促,对外界刺激(驱赶、光照等)反应迟钝。对照组的小鼠体重无明显变化(22.68±0.1916,22.11±0.3318,22.3±0.2741);而PM2.5+PA组的小鼠体重呈持续性下降趋势(22.63±0.1027,21.4±0.1692,19.03±0.7065,P<0.01)。肺组织病理切片观察发现:小鼠肺组织病理切片结果显示对照组中肺泡壁较薄,支气管结构完整,气道上皮无细胞脱落,偶有肺泡巨噬细胞和少数中性粒细胞浸润。PM2.5+PA组的肺损伤程度是最为严重的。该组肺组织有类似于肺部水肿的现象发生。可以看到肺泡壁的形态已出现畸形并且肺泡壁增厚的程度是最严重的,还伴有标志性的肺巨噬细胞和嗜中性粒细胞渗透到肺泡中。而且支气管内壁纤毛生长异常,出现气道上皮细胞脱落的现象。(6)小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-αmRNA及蛋白的表达:PM2.5+PA组IL-6、IL-8、TNF-αmRNA(9.988±1.877,2.376±0.2811,14.78±5.371)及蛋白(780.4±82.12,185.3±27.01,968.8±135)的表达水平,均显著高于对照组mRNA(1.863±0.4443,P<0.01;0.6437±0.1565,P<0.001;0.5504±0.1052,P<0.01)及蛋白(66.29±7.006,P<0.01;45.33±3.243,P<0.001;31.74±4.212,P<0.001)。结论:(1)禽舍环境中的PM2.5中的细菌种类和多样性丰富,具有潜在的危害性。(2)禽舍PM2.5可导致呼吸道炎症,并且PM2.5中生物活性成分的致炎效果更为显著。(3)绿脓杆菌能够协同禽舍PM2.5加重炎症反应,造成更严重的呼吸系统损伤,并且这一过程与NF-κB通路的激活密切相关。