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颅脑创伤是当今威胁人类生命的主要疾病之一,尽管对颅脑创伤的研究不断深入,但颅脑损伤仍具有高伤残率和高病死率。在临床上,常规的颅脑创伤诊断多依赖于神经影像学技术及格拉斯哥昏迷评分,这些诊断工具在判定患者脑的一般状况是有价值的,但它们缺乏对脑损伤程度的精确及量化的评估。在颅脑创伤急性期,是治疗干预最可能起作用的时候,没有精确生物标记物的评估严重限制了治疗干预。而蛋白质组学的迅速发展,从蛋白水平揭示疾病本质具有重大理论与实践意义,也为指导临床治疗、提高临床治疗效果带来了希望。因此脑脊液蛋白质组学为颅脑创伤蛋白质组研究提供了一个独特的窗口。
目的:寻找并鉴定重型颅脑创伤患者早期脑脊液特异蛋白,为颅脑创伤发病机制提供线索,并为临床诊断和治疗提供依据。
方法:通过腰椎穿刺的方法收集早期重型颅脑创伤患者的脑脊液标本等量混合作为实验组,然后将临床筛检排出后的其他神经系统疾病患者脑脊液标本等量混合作为对照组。采用固相Ph梯度双向凝胶电泳分离总蛋白质,凝胶经银染色后,PDQuest7.0图像分析软件进行比较分析、识别差异表达的蛋白质,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOP-MS)得到相应的肽质量指纹图谱,然后搜索数据库鉴定差异蛋白质点。
结果:1蛋白质双向凝胶电泳的结果:总共选取六幅双向凝胶电泳的图像(3幅正常组,3幅TBI组),用PDQuest7.0软件进行蛋白质点的自动探测和量化分析。在对照组检测到总蛋白质点数438±19,TBI组487±15。在Pi值4-7,相对分子量在19-80kD范围内,对照组和TBI组之间有13个蛋白质点强度存在明显差异。其中有4个蛋白质点在TBI组中的表达明显低于对照组,而其余的9个蛋白质点在TBI组中表达明显高于对照组的表达。(Fig.2)2MALDI-TOF-MS鉴定差异性蛋白质点的结果:在对照组和TBI组之间的13个差异性蛋白质点中,经质谱分析法鉴定出10个蛋白质点,而其余3个属于未知的蛋白质点,被鉴定出来的10个蛋白质点分别为胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)、组织蛋白酶D(cathepsinD,Cath-D)、谷胱甘肽合成酶(glutathionesynthetase,GSHⅡ)、过氧化物酶-6(Peroxiredoxin-6,PRDX-6)、MAPK/ERK激酶-1(MAPK/ERK-1)、双氢喋啶还原酶(dihydropteridinereductase;DHPR)、冠蛋白-1A(coronin1A,CORO1A)、膜联蛋白Ⅱ(AnnexinⅡ,ANX-Ⅱ),P21蛋白(P21protein,P21)、蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)。其中,Cath-D、GSHⅡ、PRDX-6、MAPK/RK-1、DHPR、CORO1A、ANX-Ⅱ及PKC在TBI组CSF中显著增高,而GFAP及P21则明显降低(Table.1)。这些被鉴定出来的10种蛋白质分别参与细胞的新陈代谢、应激、再生等过程。(Fig.3)结论:1初步建立了人颅脑创伤后早期脑脊液的差异蛋白质组表达谱,同时为神经系统其他疾病的研究提供了切实可行的神经蛋白质组学研究技术体系。
2急性重型TBI早期CSF病理生理变化中,本实验通过蛋白质组学研究鉴别出Cath-D、GSHⅡ、PRDX-6、MAPK/ERK-1、DHPR、CORO1A、ANX-Ⅱ及PKC显著增高,而GFAP及P21则明显降低。其中GFAP、MAPK/ERK-1及PKC可用于急性重型TBI早期的诊治。