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疟疾是由疟原虫感染导致的疾病,目前仍然是严重的全球公共卫生负担。虽然疟原虫基因组已经完成测序,但是多数基因的功能仍然未知。迄今为止,疟原虫基因功能研究依然缺乏高效的分析工具。新兴的基因编辑技术——规律成簇间隔短回文重复（CRISPR）和Cas9核酸蛋白酶系统（CRISPR/Cas9）,已成功应用到多个物种的基因组编辑和修饰。本工作中,我们利用疟疾模型—鼠约氏疟原虫,建立了基于CRISPR/Cas9技术的单基因和多基因的修饰系统。首先,我们构建了单质粒表达系统pYC,实现了 Cas9蛋白、sgRNA和同源重组模板的共同导入。Cas9/sgRNA在基因组特异位点精确产生DNA双链断裂,然后通过同源修复,实现了三种常用类型的基因修饰。我们实现了 100%效率的基因敲除（Pysera2,PyPDH/E1α）,22%-45%效率的基因加标签（PY03652）和核苷酸替换（Pyhsp70）。pYC系统修饰后虫株因为有质粒残留,不能进行下一轮的遗传修饰。针对疟原虫基因功能研究中多基因修饰的技术需求,在pYC质粒基础上,引入负筛选基因——胞嘧啶脱氨酶和尿苷磷酸转移酶双功能酶（yfcu）,和正筛选基因——人二氢叶酸还原酶（hdhfr）融合表达,建立了 pYCm单质粒系统。通过乙胺嘧啶正筛选和5氟胞嘧啶负筛选的顺序操作,可以获得没有细胞内质粒残留的基因修饰虫株。通过pYCm系统,我们首先给内源基因Pyp28加了mCherry标签,进一步在Pyp28::mCherry虫株上敲除了动合子运动相关基因Pyctrp和Pycdpk3。CRISPR/Cas9技术的建立为疟原虫基因功能研究提供了高效工具。疟原虫生活史包括哺乳动物和按蚊两个宿主的多个发育阶段,每一个发育阶段都有独特的基因表达。令人意外的是,除了和植物中Apetala2转录因子类似的转录因子家族ApiAP2,疟原虫缺乏真核生物普遍存在的转录因子种类。虽然已知某些ApiAP2基因对于疟原虫发育有影响,但是仍有很多基因功能尚未阐明。我们系统地分析了约氏疟原虫中PyApiAP2的基因功能。利用CRISPR/Cas9技术的pYC质粒或者pYCm质粒系统,我们对26个PyApiAP2基因家族成员中的24个进行了尝试敲除,其中12个可以获得敲除克隆。然后对敲除克隆进行了全生活周期的表型分析,12个成功敲除的基因有10个在有性期和蚊期发育有功能,有两个基因之前在任何种属疟原虫中都没有研究过,它们是Pyap2-g3（PY17X1417400）和Pyap2-o5（PY17X1317000）。有 7 个基因成功加了标签,蛋白表达分析显示出和功能的一致性。我们给PyAP2-G3在N端融合了 6×HA标签,发现它大部分在细胞质中定位,少量在细胞核中定位。红细胞期和配子体时期都是类似的情况;同样的,我们也给PyAP2-05加了 6×HA标签并通过间接免疫荧光检测蛋白表达,PyAP2-05在裂殖体时期主要是细胞核定位,少量胞质定位,在配子体、合子和发育中的动合子都是完全细胞核定位,在成熟动合子中不表达（或者是表达量低检测不到）。另外,有两个基因（PY17X0523100和PY17X1323500）可以被成功敲除,但是没有发现表型缺陷,基因敲除虫株可以完成整个生活史。PY17X0523100在伯氏疟原虫的同源基因没有被成功敲除。我们的工作首次在约氏疟原虫中对PyApiAP2基因家族进行了系统地功能研究,揭示了疟原虫在有性阶段和蚊期传播的关键PyApiAP2,为深入理解转录因子介导的疟原虫基因表达调控提供了新角度。