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背景与目的眼底许多疾病,如：糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)、视网膜中央静脉阻塞(Central retinal vein occlusion, CRVO)、慢性葡萄膜炎、中心性浆液性脉络膜视网膜病变(Central serous chorioretinopathy, CSC)、眼外伤等继发的黄斑水肿(Macular edema, ME)、年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration, AMD)、病理性近视(Pathological myopia, PM)和中心性渗出性脉络膜视网膜病变(Central exudative chorioretinopathy, CEC)等都可继发黄斑部脉络膜新生血管(Choroidal neovascular, CNV)。这种并发症治疗起来比较棘手,病程迁延日久,可导致视网膜渗出、黄斑出血、水肿及纤维增殖形成,甚至形成牵拉性视网膜裂孔或视网膜脱离等。传统药物对CNV治疗无明显效果,而手术治疗创伤较大,费用昂贵,且术后视力恢复一般不理想,甚至有丧失视力的恶果。随着我国人口的逐渐老龄化,其发病率也呈上升的趋势,极大的影响患者的生活质量,并给家庭和社会造成极大的负担。自从1960年眼底激光器问世以来,由于激光具有单色性好、发散角小、方向性强、相干性好、能量密度高及对眼的屈光间质通透性好等特点,故发明伊始就为眼科所采用。此后,又有多种医用激光器问世,激光治疗技术也日渐成熟,使光凝成为眼底病最常用的治疗方法。激光凝固术是建立在激光对眼组织的生物效应基础上的。激光对生物组织可产生光热效应、光化学效应、压强效应、电磁场效应及生物刺激效应。传统激光光凝是采用毫秒级脉冲激光的超阈值光凝,治疗眼底病主要通过激光的光热效应。光能被组织吸收转为热能,使蛋白质凝固变性、失活、视网膜与脉络膜粘连,可封闭视网膜裂孔。大面积视网膜光凝固则可使有效的视网膜组织面积减少,降低氧耗,改善残余视网膜的营养状态,又可使视网膜组织萎缩变薄,提高氧气从脉络膜组织向内层视网膜组织的弥散量,改善供氧状态,使刺激新生血管增殖的因子减少,达到抑制新生血管的目的。然而,传统激光光凝是一种损伤性反应：激光能量高,持续时间长,热积累及热叠加效应明显,热量传导到周围正常的视网膜、脉络膜组织并致其损伤。眼底镜下可见激光光凝斑,会产生多种并发症,如视力下降、色觉、视野、对比敏感度减退、疼痛、视网膜出血或玻璃体积血、形成视网膜前膜、视网膜裂孔和脱离,甚至继发脉络膜新生血管等,并且常规治疗剂量的激光即可导致黄斑的损伤,因而黄斑区是传统激光治疗的禁区。20世纪以来新兴的光动力疗法(Photodynamic therapy, PDT)其治疗原理是利用光敏剂和特定激光的光化学反应,使异常新生血管产生血栓。现已成功用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性、病理性近视、中心性渗出性脉络膜视网膜病变等脉络膜新生血管性疾病。PDT不会直接损伤黄斑部,因而对治疗黄斑部新生血管性疾病具有明显的优势,是黄斑部新生血管性疾病治疗的里程碑。但是,PDT治疗因光敏剂价格昂贵,其治疗又有诱发脉络膜缺血、新生血管生成、疤痕形成等风险,常不能有效改善视功能。近年来新研发的抗血管内皮生长因子药物如贝伐单抗、雷珠单抗以及即将上市的康柏西普可有效预防脉络膜新生血管的形成,降低脉络膜新生血管性疾病的复发率,减轻黄斑水肿,预防眼底出血,改善视功能,但药物价格昂贵,且需多次玻璃体腔注射,有增加眼内炎、视网膜脱离等并发症及抗原抗体复合物代谢性问题的风险。因此,如何寻找一种安全有效、经济实惠、并发症较少的治疗方法,是现今人们普遍关心的问题。近年来,低强度光凝(Minimum intensity photocoagulation, MIP)概念的提出为我们提供了新的治疗思路。低强度光凝是将激光能量控制在既能达到有效治疗效应,同时又将对组织损伤降到最小,能避免医源性损伤的一种激光治疗方法。据近代研究,视网膜色素上皮(Retinal pigment epithelium, RPE)细胞在眼内参与多种代谢,可分泌多种细胞生长因子及神经营养因子,为神经视网膜和脉络膜提供营养,并保持其内环境的平衡稳定,决定视网膜结构和功能的正常发育和维持,抑制新生血管的形成。正常生理状态下,RPE细胞相对静止无增殖现象,但受到理化因素、炎症等因素的刺激时将发生增殖迁移,并分泌多种细胞生长因子。当促血管生长因子和抑制血管生长的因子平衡状态受到破坏时,将促进新生血管的形成,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)具有很强的促新生血管形成、增加血管通透性的作用；碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, b-FGF)具有强的促内皮细胞分裂增殖的作用；色素上皮源性因子(Pigment epithelium-derived factor, PEDF)具有很强的抑制新生血管生成、营养视网膜及神经元等神经细胞的作用。基于以上认识,人们开发了专门针对视网膜色素上皮的微脉冲半导体激光治疗技术。微脉冲半导体激光是一种不同的激光治疗模式。810nm半导体激光是一种近红外激光,穿透性较强,可达到视网膜色素上皮层及脉络膜。它与传统的单一脉冲毫秒级阈值上激光不同,微脉冲激光以一系列重复短促的脉冲形式释放,脉宽(脉冲时间)可达到微秒级,故称微脉冲激光。微脉冲激光通过采用合适的激光参数(包括能量、曝光时间、负载系数及光斑大小等),以低负载系数模式控制热量产生与叠加,可进行损伤阈值下的光凝。微脉冲激光的脉冲作用时间极短,其脉冲间歇时间(热缓和时间)又很长,热叠加效应很弱,其上升的温度只产生非常小而不显著的蛋白质变性,加之810nm激光传导时呈正向窄角分布,热传导范围小,对附近视网膜影响极小。RPE对810nm激光的吸收率相对较底,这就有可能获得色素上皮细胞潜在的亚失活效应,实现真正的阈值下光凝。810nm微脉冲半导体激光对色素上皮细胞作用的专一性,对内层视网膜的损伤极小,既可保存视野、中心视力及颜色对比敏感度,又可达到阻塞新生血管的目的。目前,阈值下微脉冲半导体激光已成功用于治疗糖尿病视网膜病变和视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性玻璃膜疣及中心性浆液性脉络膜视网膜病变等,其具体机制尚不十分清楚。目前推测,其治疗机制源于激光对视网膜色素上皮细胞的光生物调制效应。微脉冲810nm半导体激光阈值下光凝可能会刺激RPE细胞增殖、迁移,修复视网膜脉络膜屏障功能并增强RPE细胞的吞噬功能,促进对脱落的视锥视杆细胞膜盘及玻璃膜疣的吞噬降解,此外,它可刺激RPE细胞分泌各种生长因子及神经营养因子,使促血管生长因子和抑制血管生长因子达到新的平衡,进而抑制视网膜新生血管及脉络膜新生血管的生成。为此,本研究拟通过观察微脉冲810nm半导体激光阈值下光凝色素兔视网膜,探讨其对色素兔视网膜各层形态结构的影响以及对视网膜色素上皮细胞分泌VEGF、b-FGF及PEDF的影响。材料与方法激光设备：采用美国IRIDEX医疗器械公司生产的IRIS Oculight SLx810nm半导体激光器并调成微脉冲模式。激光参数：脉冲时间200μs,间歇时间1800μs,频率500Hz,脉冲周期2.0ms。其负载系数为10%,包络时间为200ms,光斑直径200μm。治疗在0.1-0.3s持续时间中重复进行。实验动物：12只健康青紫蓝兔随机分为两组：实验组8只(16眼)行光凝,对照组4只(8眼)均不作光凝。实验组8只(16眼)采用阈值下微脉冲半导体激光避开视盘及有髓神经纤维行全视网膜光凝。实验组动物在光凝前及光凝后即刻、光凝后1天、3天、7天分别行眼底照相、光学相干断层扫描(Optical coherence tomography, OCT)检查及荧光素血管造影(Fluorescein angiography, FFA)检查。分别于光凝后1天、3天、7天、14天,实验组随机选取2只兔子,对照组随机选取1只兔子处死,摘取右眼球行石蜡组织切片,选取光凝部位组织行HE染色,在生物显微镜下观察激光对视网膜组织结构的影响；分别行鼠抗兔VEGF单克隆抗体(Abcam,1：50稀释)、鼠抗人PEDF单克隆抗体(Abcam,1：100稀释)或鼠抗人b-FGF单克隆抗体(Abcam,1：300稀释)免疫荧光染色,荧光显微镜下观察视网膜各层结构VEGF、PEDF及b-FGF的表达变化。同时,分别于光凝后1天、3天、7天、14天摘取左眼球无菌环境下提取视网膜组织的RNA,以β-actin为内参,采用RT-PCR法反转录内参基因β-actin及目的基因VEGF、PEDF和b-FGF,运用2-△△‘法计算实验组激光后1天、3天、7天、14天VEGF mRNA、PEDF mRNA、b-FGF mRNA的相对表达量。所有数据均采用SPSS18.0统计软件处理,计量资料数据均以均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析(ANOVA)及LSD-t检验分析数据。结果微脉冲810nm半导体激光阈值下光凝后兔眼视网膜OCT检查未见明显的损伤变化,FFA检查未见血管荧光素渗漏,仅激光后第1天可见不明显的激光斑透见荧光,第14天透见荧光减弱；视网膜组织切片HE染色各层结构完整,激光后第1天激光部位视网膜色素上皮层欠规整,光凝后3天基本恢复正常；免疫荧光结果表明,正常组兔眼视网膜VEGF在神经纤维层、神经节细胞层、内丛状层、内核层、视锥视杆细胞层、视网膜色素上皮层均有表达；光凝组VEGF在视锥视杆细胞层及RPE层表达明显增强。正常组兔眼视网膜PEDF在神经纤维层、神经节细胞层、内丛状层、内核层、视网膜色素上皮层表达；光凝组PEDF在视锥视杆细胞层也有表达,在视网膜色素上皮层表达明显增强。正常组兔眼视网膜b-FGF在视锥视杆细胞层、视网膜色素上皮层表达；光凝组b-FGF在神经纤维层、神经节细胞层也有表达。RT-PCR结果表明,激光组VEGF mRNA、PEDF mRNA、b-FGF mRNA含量均增多,其中光凝后第1天PEDF mRNA表达最高,第3天略有下降,与其他时间点比较均差异显著(P<0.05), b-FGF mRNA第1天增高最明显,但各个时间点比较,统计学差异不显著(P>0.05),光凝后第3天VEGF mRNA表达增高最明显,与其他时间点比较差异显著(P<0.05),光凝后14天三种细胞因子增高幅度相近。结论1.微脉冲810nm激光阈值下光凝不会造成视网膜形态结构的损伤。2.微脉冲810nm激光阈值下光凝可刺激视网膜色素上皮细胞增殖修复,并表达分泌VEGF、PEDF、b-FGF三种细胞因子,使其协调增高,预防新生血管的生成。