【摘 要】
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目的:本实验以人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM为研究对象，通过构建特异性干扰GnT-Ⅴ表达的shRNA，并将shRNA转染入人肝癌HepG2/ADM细胞株，探讨GnT-Ⅴ表达抑制对肝癌细胞耐药性的影响
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目的:本实验以人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM为研究对象，通过构建特异性干扰GnT-Ⅴ表达的shRNA，并将shRNA转染入人肝癌HepG2/ADM细胞株，探讨GnT-Ⅴ表达抑制对肝癌细胞耐药性的影响。 方法:针对GnT-Ⅴ基因设计小干扰RNA序列，并将其整合入质粒构建shRNA表达载体。用脂质体法将shRNA转染入对数生长期HepG2/ADM细胞，将实验分为三组。shRNA干扰组（HAS组）:该组细胞转染入含GnT-Ⅴ干扰序列的shRNA。空白质粒对照组(HAN组):该组细胞转染入含一段无义序列的shRNA作为阴性对照。正常细胞组(NC组):该组仅行HepG2/ADM细胞培养，但不做任何干预处理。转染完成后通过荧光显微镜观察转染效率;RT-PCR检测转染后GnT-Ⅴ、P-gp、MRP的mRNA表达情况;MTT检测不同浓度阿霉素在24h、48h对转染后各组细胞的生长抑制率;TUNEL法检测转染对细胞凋亡的影响。所测数据采用均数±标准差（(x)±s）表示，所采集数据的统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行，两样本均数的比较采用t检验，多样本均数的比较采用单因素方差分析法（One-Way ANOVA）。 结果:(1) shRNA成功转染入HepG2/ADM细胞，免疫荧光显微镜下可见转染成功细胞发绿色荧光，转染率为60％左右。(2) shRNA转染后，HAS组细胞中GnT-Ⅴ表达明显下降。明显低于HAN组与NC组(P＜0.01)，差异有统计学意义。(3) HAS组P-gp、MRP mRNA表达较HAN组低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。而P-gp、MRP mRNA表达量在HAN组与NC组之间无明显差异(P＞0.05)。(4) MTT结果显示，在24h时，当ADM浓度为0.5μg/ml时，HAS组细胞抑制率较HAN组、NC组明显(P＜0.05)，而其余各浓度三组细胞的生长抑制率比较无统计学差异(P＞0.05)。在48h，当ADM浓度为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml时，对HepG2/ADM细胞的生长抑制作用在HAS组较HAN组和NC组明显，差异有统计学意义(P＜0.05)，并且浓度越高，差异越明显。而HAN组与NC组比较，差异无统计学意义。(5) TUNEL检测结果显示:HAS组细胞凋亡率为(13.73±0.47)％较HAN组(9.77±0.67)％增加，具有明显统计学差异(P＜0.01)，但NC组细胞凋亡率为(0.86±0.13)％，其凋亡率远远低于HAN组、HAS组细胞。 结论:(1) GnT-Ⅴ shRNA能有效的抑制肝癌细胞GnT-Ⅴ的表达。(2) GnT-Ⅴ与肝癌细胞的耐药表型有关，其表达抑制可以降低肝癌细胞相关耐药蛋白mRNA的表达水平，还能增加肝癌细胞的凋亡率，从而增加细胞对化疗药物的敏感性，通过抑制GnT-Ⅴ的表达可能成为提升肝癌化疗效果的新途径。
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