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人类每天合成IgA的数量超过其他各类Ig每天合成数量之总和。血液中IgA作用，包括能否介导吞噬细胞对病原体产生调理吞噬作用，目前尚不十分清楚。鉴于近来研究发现血液中性粒细胞可组成性表达FcαRI(CD89)。我们提出血液中IgA与相应病原体结合后，有可能介导吞噬细胞产生调理作用的设想。为此，本课题组在前期工作基础上，构建了pSC-dhfr-signal-BPI600-Fcα1重组质粒，将其转染CHO-dhfr细胞获得目的重组蛋白，并对其生物学作用，如中和内毒素、杀菌和调理作用进行了初步研究。主要研究工作如下：
一、pSC-dhfr-signal-BPI600-Fcα1重组质粒的构建和鉴定。
1.pUC18-Fcal重组质粒的构建和鉴定。
以pFastBacTM-Fcα1质粒为模板，在引物P1/P2的引导下，通过PCR扩增获得Fcα1目的基因片段(638bp)，将其与pUC18表达载体(2668bp)连接获得pUC18-Fcα1重组质粒(3298bp)；后者转化E.coli DH5α感受态菌，经筛选获得阳性克隆菌后，提取质粒通过酶切分析证实，Fcα1基因片段与pUC18正确整合组成pUC18-Fcα1重组质粒。
2.signal-BPI600目的基因片段的制备。
双酶(KpnⅠ/HindⅢ)切pSNAV-signal-BPI600-Fcγ1重组质粒，采用DEAE-纤维素膜法回收signal-BPI600目的基因片段(693bp)，经酚-氯仿抽提-乙醇沉淀，获得纯化signal-BPI600目的基因片段。
3、pSC-dhfr-△SphI中间载体的构建。
酶(SphI)切pSC-dhfr真核表达载体，回收大片段，通过连接反应使其自连产生缺失SphI酶切位点间片段(72 bp)的pSC-dhfr-△SphI中间载体，使dhfr基因表达弱化，目的基因拷贝数增加。
4、pSC-dhfr-signal-BPI600-Fcα1真核表达载体的构建和鉴定。
双酶(KpnⅠ/SalⅠ)切pSC-dhfr-△SphI中间载体，获得线性pSC-dhfr载体(5005bp)；双酶(HindⅢ/SalⅠ)切pUC18-Fcα1重组质粒，获得Fcα1目的基因片段(630bp)；通过连接反应，将上述两个基因片段与signal-BPI600(693bp)基因片段连接，组成pSC-dhfr-signal-BPI600-Fcα1重组质粒(6328bp)。酶切鉴定和DNA测序分析证实：pSC-dhfr-signal-BPI600-Fcα1重组质粒构建正确。
二、目的重组蛋白在CHO-dhfr-细胞中的表达及其生物学活性的初步研究。
1.目的基因对CHO-dhfr-细胞的转染和阳性细胞克隆的筛选。
按照LIPOFECTAMINE2000脂质体转染说明，将pSC-dhfr-signal-BPI600-Fcα1重组质粒与脂质体混合后，加入含10％透析型胎牛血清的IMDM选择培养液中培养的CHO-dhfr-细胞中培养共育1-2天，完成转染。采用有限稀释法将转染后的CHO-dhfr-细胞置于96孔板内，每孔加入氨甲喋呤(终浓度100nmol/ml)进行筛选，获得30个抗性细胞克隆。采用斑点印迹法检测鉴定获得一个高表达抗性细胞克隆，命名为D7细胞株；将其置于氨甲喋呤浓度梯度增加的培养液中培养，获得稳定高效表达目的蛋白的CHO-D7细胞株。
2、目的基因在CHO-dhfr-细胞中转录水平的表达。
以D7细胞中mRNA为模板，在引物P3/P4引导下，其RT-PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中出现一条标志性300bp的DNA条带，与实验预期结果相符；空载体转染细胞RT-PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中未见300bp的DNA条带。上述结果表明signal-BPI600-Fcα1目的基因在CHO-dhfr-细胞内转录成功。
3、目的基因在CHO-dhfr-细胞中蛋白水平的表达
免疫细胞化学法检测发现，D7细胞中出现棕黄色斑点，为阳性反应；空载体转染细胞中未见棕黄色斑点，为阴性反应。证实D7细胞中存在能与抗人Fcα1抗体结合的成分，即目的基因产物中含有IgA1 Fc片段；
改良酶联免疫吸附实验检测表明：D7细胞培养上清中含有能与抗人BPI抗体结合的成分，即目的基因产物含有BPI23片段。综合上述免疫细胞化学和改良酶联免疫吸附实验检测结果，可以判定目的基因产物为BPI23-Fcα1重组蛋白。
4、D7细胞培养上清中目的基因产物的浓缩和Western-blot鉴定。
收获D7细胞不含蛋白、不含抗生素的48h培养上清液置于30KD超滤管中，离心收获管中截留液，即含目的基因产物的浓缩液。
Western-blot鉴定发现还原情况下，D7细胞培养上清浓缩液在泳道上出现一条相对分子量约为45KD的条带，与实验设计预期结果相符。空载体转染细胞培养上清浓缩液在泳道上未出现上述条带。证实：D7细胞培养上清液中的目的基因产物为BPI23-Fcα1目的重组蛋白。
5、目的基因产物生物学活性的初步测定。
(1)内毒素中和作用：采用鲎试剂检测发现，一定量D7细胞培养上清浓缩液和空载体转染细胞培养上清浓缩液分别与一定量内毒素作用后，二者OD545nm.值分别为0.199±0.014和0.319±0.079，存在显著性差异(t=12.8，P<0.05)。表明D7细胞培养上清中BPI23-Fcα1目的重组蛋白具有中和内毒素的作用。
(2)E.coli杀伤作用：一定量D7细胞培养上清浓缩液和空载体转染细胞培养上清浓缩液分别与一定数量E.coli菌液作用，二者每个平板菌落数分别为80.66±2.08和100.66±2.51，具有统计学差异，表明D7细胞培养上清中BPI23-Fcα1目的重组蛋白对E.coli具有一定的抑杀作用。
(3)调理杀菌作用：D7细胞上清液中目的基因产物和血液中吞噬细胞对E.coli具有杀伤和吞噬杀伤作用。实验组(目的基因产物+吞噬细胞)菌落数(45.33±4.93)虽然低于吞噬细胞对照组(56.66±3.06)和目的基因产物对照组(83.33±4.50)，但差异不够显著。提示实验组菌落数较低可能是吞噬细胞与目的基因产物作用相加所致，而不是目的基因产物介导吞噬细胞产生调理作用所致。