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第一章，天然化合物DC250188对脂肪细胞脂代谢和adiponectin合成的调控作用及其机理研究 研究背景和目的： 糖尿病是继肿瘤、心脑血管疾病后第三位严重威胁人类健康的慢性病。脂肪组织作为机体的主要能量储存器官和内分泌器官，其代谢功能障碍和脂肪因子分泌失调在2型糖尿病的发生及发展中起着关键作用。DC250188系本实验室前期研究中发现的具有显著抗糖尿病作用的天然化合物单体，其作用机理与激活骨骼肌组织中AMPK信号通路的活化有关，然而该化合物对脂肪组织的调控作用尚不清楚。本论文拟研究DC250188对脂肪细胞的主要脂代谢功能和adiponectin合成的调控作用及其与AMPK活化的关系，初步阐明DC250188治疗糖尿病的分子机理，为该化合物及其衍生物的进一步研究开发提供了理论基础。 实验方法： (1)ob/ob小鼠长期口服DC250188后，观察糖脂代谢相关的血清生化指标和小鼠体温变化，用real-timePCR检测网膜脂肪中与脂代谢功能和adiponectin合成相关基因的表达水平，用westernblot检测AMPK磷酸化水平变化；(2)3T3-L1脂肪细胞经DC250188长期给药后，观察脂肪细胞在分化、脂解、脂肪酸氧化和脂肪合成等脂代谢功能的变化，检测与脂代谢功能和adiponectin合成相关基因的表达变化，AMPK和ACC磷酸化水平变化以及FFA和adiponectin分泌。(3)ob/ob小鼠的网膜脂肪组织块经DC250188长时间离体孵育后，观察其中adiponectinmRNA表达变化；(4)采用AMPK抑制剂CompoundC和AMPKα1RNA干扰方法，研究DC250188对脂代谢和adiponectin合成的调控作用与AMPK信号通路的关系。(5)采用UCO2RNA干扰的方法观察Dc250188对adiponectin的调控作用与UCP2的关系。 实验结果： (1)DC250188增加脂肪细胞的AMPK磷酸化水平ob/ob小鼠连续16天口服给予DC250188治疗后，其网膜脂肪组织中AMPK磷酸化水平显著升高；离体3T3-L1脂肪细胞经DC250188短期处理后AMPK磷酸化水平显著增加，并呈现明显的时间和剂量依赖性；而经DC250188长期处理后，3T3-L1脂肪细胞中AMPK和ACC磷酸化水平均显著升高。 (2)DC250188抑制3T3-L1脂肪细胞的脂肪酸释放，AMPK活化参与该作用DC250188可抑制3T3-L1细胞分化，长期作用后，DC250188可通过增加3T3-L1脂肪细胞脂肪酸氧化、抑制脂解和脂肪合成而导致细胞游离脂肪酸释放的减少，其中，DC250188促进游离脂肪酸氧化的作用与AMPK相关，而对脂解和脂肪合成的抑制与AMPK无关。 (3)DC250188通过AMPK活化诱导白色脂肪细胞向棕色脂肪细胞转化ob/ob小鼠经DC250188长期治疗后，其直肠温度增加，网膜脂肪组织中的线粒体生物合成相关基因(PGC-1α、NRF-1、mtTFA)和棕色脂肪标志蛋白UCP1的mRNA水平上调；在3T3-L1脂肪细胞中，DC250188也增加PGC-1α、NRF-1、mtTFA和UCP1mRNA水平，而这些作用可被CompoundC预处理和AMPKα1RNA干扰所抑制。 (4)DC250188通过AMPK活化诱导UCP2mRNA表达并调控adiponectin合成及分泌ob/ob小鼠经DC250188长期治疗后，其网膜脂肪组织的adiponectinmRNA表达上调：离体的ob/ob小鼠网膜脂肪组织块经DC250188孵育后，adiponectinmRNA表达也上调；3T3-L1脂肪细胞经DC250188长期处理后，adiponectinmRNA表达和蛋白分泌均增加，且AMPKα1RNA干扰后可以逆转DC250188对adiponectin的调控作用；DC250188增加ob/ob小鼠网膜脂肪组织和3T3-L1细胞的UCP2mRNA表达，而UCP2RNA干扰可以抑制DC250188对adiponectin的作用，且AMPKα1RNA干扰可抑制DC250188对UCP2mRNA表达的作用。 结论： 天然化合物DC250188在脂肪细胞中具有调控细胞脂代谢和adiponectin合成的双重作用。一方面，DC250188通过增加脂肪细胞的脂肪酸氧化、抑制脂肪分解和脂肪合成调控脂肪细胞的能量代谢平衡，导致脂肪细胞的脂肪积累和脂肪酸释放减少，AMPK参与DC250188对脂肪酸氧化的促进作用，但与。DC250188对脂解和脂肪合成的抑制作用无关；另一方面，DC250188通过AMPK活化诱导线粒体合成增加以及UCP2表达，调控adiponectin合成分泌。 第二章，二甲双胍对脂肪酸释放的调控及其机制研究 研究背景和目的： 二甲双胍是治疗2型精尿病的经典药物，在肥胖和糖尿病患者体内可以通过降低血清游离脂肪酸而改善机体的胰岛素敏感性。虽然二甲双胍的作用机理已得到较为广泛的研究，但有关其对脂肪细胞脂代谢的调控和降低血清游离脂肪酸水平的细胞和分子基础尚缺乏系统的研究。因此，本论文将在发现二甲双胍具有抑制脂肪细胞的脂肪酸释放的基础上，系统研究二甲双胍对脂肪分解、脂肪合成和脂肪酸氧化的调控作用及其与AMPK活化的相关性，从而揭示二甲双胍降低机体血清游离脂肪酸水平的细胞和分子基础，为其作用机理研究提供了新内容。 实验方法： (1)3T3-L1脂肪细胞经二甲双胍长期给药后，检测细胞培养液中的游离脂肪酸和甘油水平，并用westernblot检测脂肪细胞中的AMPK和ACC磷酸化水平；(2)采用3H-pamitateacid检测二甲双胍对脂肪酸氧化的作用，用14C-acetatesodium检测二甲双胍对脂肪合成的作用；(3)采用AMPK抑制剂compoundC和AMPKα1RNA干扰方法，研究二甲双胍的调控作用与AMPK信号通路的关系；(4)用real-timePCR方法检测脂肪细胞和组织中线粒体合成相关基因的mRNA表达和线粒体DNA复制水平；(5)采用荧光染料MitoTrackerGreen检测细胞内线粒体含量；(6)DIO小鼠模型长期口服二甲双胍后，观察血清游离脂肪酸水平、肠系膜脂肪组织中的AMPK磷酸化水平和线粒体合成相关基因表达。 实验结果： (1)二甲双胍抑制3T3-L1细胞的脂肪酸释放，AMPK活化参与该作用二甲双胍处理3T3-L1细胞24h后可以剂量依赖地抑制细胞的脂肪酸分泌，同时增加AMPK的磷酸化水平，而将AMPKα1RNA干扰后，这个作用被部分逆转。(2)二甲双胍抑制3T3-L1细胞的脂肪分解，但该作用和AMPK活化无关2mM的二甲双胍处理3T3-L1细胞24h后，细胞的甘油释放减少21.9％，将AMPKα1RNA干扰后，二甲双胍对脂解的抑制作用不受影响。 (3)二甲双胍抑制3T3-L1细胞的脂肪合成，但该作用和AMPK活化无关2mM和4mM二甲双胍在NSsiRNA组3T3-L1脂肪细胞中处理24h后，细胞中的脂肪合成作用分别减少22.7％和41.6％，而将AMPKα1RNA干扰后，二甲双胍对脂肪合成的抑制作用不受影响 (4)二甲双胍以AMPK依赖的方式增加3T3-L1细胞的脂肪酸氧化2mM的二甲双胍处理3T3-L1细胞24h后，细胞的脂肪酸氧化增加31.5％，而采用20μM的AMPK抑制剂CompoundC预处理1h或者将AMPKα1RNA干扰后，二甲双胍对脂肪酸氧化的促进几乎完全消失。 (5)二甲双胍以AMPK依赖的方式增加3T3-L1脂肪细胞的线粒体合成二甲双胍可剂最依赖地增加3T3-L1细胞中的线粒体含量和线粒体生物合成相关基因PGC-1α、NRF-1、mtTFA的mRNA表达以及线粒体DNA复制水平，然而将细胞中AMPKα1RNA干扰后，二甲双胍的这些作用几乎完全消失。 (6)二甲双胍在DIO小鼠中的作用二甲双胍长期连续给药后可增加DIO小鼠肠系膜脂肪中的AMPK磷酸化水平，并增加线粒体生物合成相关基因PGC-1α、NRF-1、mtTFA的mRNA表达和线粒体DNA复制水平，小鼠血清游离脂肪酸水平也呈现明显的下降趋势。 结论： 二甲双胍可通过抑制脂肪分解、促进游离脂肪酸氧化而显著降低3T3-L1脂肪细胞游离脂肪酸的释放，AMPK的活化并不参与二甲双胍对脂肪细胞脂解的抑制作用，但可直接或通过增加线粒体生物合成而间接参与二甲双胍促进脂肪酸氧化的作用。