论文部分内容阅读
羊毛是重要的畜牧业产品之，也是重要的纺织工业原材料。羊毛的品质主要表现在羊毛的细度和卷曲度上，随着羊毛纺织技术的不断提高和人们对自然、高档、轻薄和柔软服饰的追求，直径在21.5μm以下的细羊毛的需求量显著增加。近些年来，我国的羊毛产量虽然不断增长但是高品质羊毛产量不足，羊毛质量参差不齐，羊毛进口量逐年攀升。因此，培育出产高品质、高产量羊毛的绵羊品种成为绵羊育种的时代需求，分子标记育种是实现高品质绵羊育种的重要辅助手段，能够大大加快育种进程。鉴于此，本论文以中国五个绵羊品种（中国美利奴、萨克福、湖羊、罗姆尼、中国美利奴×湖羊）作为研究对象，采用分子生物学技术手段研究与羊毛细度相关的候选基因（KAP6, KAP7和KAP8基因）在不同品种绵羊皮肤中的表达量，分析基因的编码区及其侧翼序列的多态性并用染色体步移法克隆其上游未知序列，最后对编码区上游序列进行生物信息学分析。从而在转录水平和基因组水平上探讨羊毛品质候选基因的多态性与羊毛直径品质间的关系，为细毛羊育种提供理论参考。结果总结如下：（1）KAP6, KAP7和KAP8基因在毛囊组织中的表达采用荧光实时定量PCR（Real-time Quantity PCR，RQ-PCR）检测KAP6,KAP7和KAP8基因在萨福克羊（粗毛羊）和中国美利奴羊（细毛羊）皮肤毛囊中的表达水平。结果表明，mRNA表达量和羊毛直径高度正相关，相关系数分别为0.941（P=0.00）、0.842（P=0.01）和0.948（P=0.00）；三个基因在萨福克羊皮肤组织中的表达量显著高于在中国美利奴羊皮肤组织中的表达量，分别达到4.23、5.74和5.87倍。（2）四个绵羊品种KAP6, KAP7和KAP8基因的克隆及其多态性研究用PCR技术扩增绵羊KAP6, KAP7和KAP8基因，采用直接测序和载体克隆测序技术，检测其在中国美利奴羊、湖羊、罗姆尼羊和美利奴-湖羊杂交羊中四个群体的多态性。结果发现，KAP6基因检测到六种多样性序列，KAP7基因检测到两种多样性序列，KAP8基因检测到五种多样性序列。在KAP7基因位点发现的两个品种特异性序列和个品种特异性SNP点值得深入研究。（3）KAP6, KAP7和KAP8基因上游序列的扩增及其生物信息学分析根据GenBank的KAP6, KAP7和KAP8基因的序列设计特异性引物，采用TAIL-PCR（交错式热不对称PCR，thermal asymmetric interlaced PCR）分别克隆获得三个基因5′未知序列片段，然后通过PCR克隆测序的方法分别得到KAP6, KAP7和KAP8基因CDS区上游未知序列1877bp、3224bp和1826bp的核酸序列信息。然后用DNAman序列分析软件将测得的未知序列与GenBank中已知序列拼接，分别得到KAP6, KAP7和KAP8基因CDS区上游2918bp，3619bp和2801bp长的片段。对上游序列采用生物信息学分析软件Genomatrix分析，得到的结果进行生物信息学预测发现了些调控元件的结合位点，为进步分析KAP6, KAP7和KAP8特异性表达及其活性和功能奠定了基础。