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目的：前列腺癌是美国男性最常见的恶性肿瘤，死亡率占第二位。近年来在中国也逐渐成为威胁男性生命健康的重要问题。尽管局部治疗包括根治性前列腺切除术和放疗能有效治疗早期局部病灶，但大多数患者在局部治疗后出现复发。雄激素阻断治疗通常对复发或转移的前列腺癌有效，但其副作用很多，并且这些病人最终会转变为激素难治性前列腺癌。目前对激素难治性前列腺癌尚无有效的治疗措施。因此，研究新的、有效的治疗方法尤为重要。
近年来，肿瘤的基因治疗已成为研究热点，其中自杀基因疗法是众多基因治疗策略中最有前途的策略之一。单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)/更昔洛韦(GCV)系统是目前自杀基因疗法中应用最广泛、最标准的治疗方案。HSV-TK基因转入靶细胞后能选择性磷酸化GCV，后者再由内源性细胞激酶磷酸化转化为三磷酸GCV，三磷酸GCV可直接结合细胞DNA，干扰DNA的正常合成，最终导致DNA合成终止和细胞死亡。自杀基因HSV-TK/GCV系统的另一重要特征是旁观者效应，即CCV除了杀死转染了TK的细胞，而且也能杀死未转染TK的细胞。这种效应有效扩大了自杀基因疗法的杀伤作用。自杀基因HSV-TK/GCV系统在多种恶性肿瘤的体内外实验中，均显示出有效杀伤作用。多项研究证实该系统在体外对鼠或人前列腺癌细胞有显著的细胞毒性作用，在活体内显著抑制前列腺癌的局部生长以及转移。然而，这种自杀基因疗法仍无法诱导肿瘤的完全消退。众所周知，诱导细胞凋亡是放疗和化疗药物发挥抗肿瘤效果的机制之一。有研究表明凋亡在HSV-TK/GCV自杀基因系统杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞增殖的过程中发挥了关键作用。因此，联合其它一些药物以加速凋亡应该是一个更有前景的方法。
流行病学研究表明饮食中摄入葱属类植物尤其是大蒜，可能减低多种恶性肿瘤的风险，包括前列腺癌。大蒜中的有机硫复合物包括二烯丙基一硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)、二烯丙基三硫化物(DATS)在防癌效应中发挥了重要作用。有机硫复合物具有很多生物和药理学活性，特别是在各种化学致癌物诱导的动物癌症模型中，可显现出明显预防癌症的作用。最近研究表明DADS和DATS可通过诱导凋亡和/或细胞周期阻滞来抑制培养的癌细胞增殖，并且DADS和DATS能显著诱导体外培养的肿瘤细胞凋亡，抑制细胞生长；同时也能显著抑制裸鼠原位移植瘤的生长，阻止转基因小鼠肿瘤模型中的肿瘤浸润和转移。研究证明，与DADS相比，DATS具有更强的诱导凋亡、抑制癌细胞增值能力。那么，DATS联合TK/GCV作用于前列腺癌细胞是否能增强后者的细胞毒性?如能产生协同的效果，其机制是什么?这正是本论文研究的主要问题。
本研究用质粒tgCMV/HyTK，采用基因转染技术，构建稳定表达TK基因的人前列腺癌细胞株；用GCV联合DATS处理细胞株，测定不同组间的细胞生长、细胞凋亡、凋亡相关蛋白；证实GCV联合DATS抑制前列腺癌细胞生长的协同效应，分析联合治疗效果的可能机制，进而为前列腺癌的治疗提供一定的实验基础和理论依据。
方法：
⑴用脂质体Lipofectamine2000将质粒tgCMV/HyTK转染前列腺癌PC-3细胞(以下简称PC-3/TK)。潮霉素B筛选转染细胞并挑选单克隆细胞扩大培养。用未转染的PC-3作阴性对照。RT-PCR鉴定TK基因表达。
⑵采用MTT法测定GCV和DATS处理细胞后的细胞增殖能力。用不同浓度的DATS或GCV，培养细胞24 h，48 h，72 h，用MTT试剂盒检测活细胞，酶标仪测定吸光度A值。计算各组的细胞存活率。细胞存活率(％)=用药组活细胞A值/对照组活细胞A值×100％。以细胞数减少50％的药物浓度确定为DATS和GCV的IC50。为评价DATS和GCV的相互作用，用IC50浓度的DATS联合不同浓度的GCV处理前列腺癌细胞48 h后，用MTT法检测活细胞，计算各组的细胞存活率。
⑶采用中效原理分析得出药物联合作用指数，评价DATS和GCV是否有协同作用。
⑷各组细胞被相应的药物处理72h后，用流式细胞仪分析细胞中sub-G1 DNA的含量；亦用DAPI染色法在荧光显微镜下观察药物诱导的细胞凋亡，核收缩和破裂的细胞为阳性细胞，未处理细胞为阴性对照。
⑸细胞被相应的药物处理72 h后，裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。用BCA法测定蛋白浓度。Western blotting检测凋亡调控蛋白Bcl-2、Bax、Bcl-xL和Bcl-xS表达，用α-tubulin表达作为内参。
⑹用Caspase-3比色分析试剂盒分析药物处理后细胞的Caspase-3活性，最后在酶标仪405nm比色。样品A405值与对照样品A405值的比值显示为Caspase-3活性。
结果：
①RT-PCR证实成功构建了稳定表达TK基因的前列腺癌细胞系PC-3/TK。
②GCV和DATS均显著降低人前列腺癌细胞系PC-3/TK的活细胞数量。GCV和DATS的细胞毒性表现为显著的剂量和时间依赖性。GCV和DATS作用72 h的IC50分别为13μmol/L和14μmol/L。GCV联合DATS处理细胞48 h后，其细胞存活率与单用GCV处理组相比显著减低(p＜0.05)。DATS增强了GCV对PC-3/TK细胞的杀伤效果。
③药物联合作用指数结果显示GCV和DATS具有协同细胞毒性作用。
④用流式细胞分析细胞sub-G1 DNA含量来评价诱导凋亡效果。与对照组(1.2±0.7)％相比，DATS组(32.6±3.8)％，GCV组(18.3±1.2)％和GCV联合DATS组(53.9±6.0)％的sub-G1期细胞显著增加中＜0.05)；与DATS组、GCV组相比，GCV联合DATS组sub-G1期细胞的数量显著增加(p＜0.05)。在DAPI染色分析中，与未处理细胞相比，在DATS组、GCV组和GCV联合DATS组处理72 h后均观察到明显的核浓缩和破碎。
⑤与对照组相比，DATS和GCV处理组Bcl-2的表达均降低(p＜0.05)。与单用GCV或DATS组相比，GCV联合DATS处理组的Bcl-2表达显著降低(P＜0.05)。与对照组相比，DATS和GCV处理组显著降低Bcl-xL表达(p＜0.05)。与单用GCV或DATS组相比，Bcl-xL蛋白在GCV联合DATS组中表达最低(p＜0.05)。另一方面，所有药物处理后Bax或Bcl-xS蛋白表达水平没有明显变化。
⑥与对照组相比，DATS组(204±9)％、GCV组(176±10)％、GCV联合DATS组(390±20)％在72 h caspase-3活性均显著增加(p＜0.05)。与DATS组、GCV组相比，GCV联合DATS组的caspase-3活性增加最为明显(p＜0.05)。
结论：⑴成功构建了稳定表达TK基因的人前列腺癌细胞系PC-3/TK。⑵GCV、DATS均能有效杀伤PC-3/TK细胞，细胞毒性呈剂量和时间依赖性，诱导细胞凋亡是二者发挥抗肿瘤效果的重要机制之一。⑶DATS能增强HSV-TK/GCV自杀基因系统对前列腺癌细胞的杀伤效应，而加速细胞凋亡在这一过程中起关键作用。⑷GCV和DATS加速PC-3/TK细胞发生凋亡可能与Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达及Caspase-3活性变化有关。