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本论文以巴西蕉(Musa AAA Cavendish cv.Baxi)的横切薄片和贡蕉(Musa AAPisang Mas cv.Mas)的胚性悬浮系为材料,建立香蕉的再生体系,同时对其进行优化;并采用农杆菌介导法将phyB基因导入巴西蕉品种,优化遗传转化体系,获得相应的转基因植株。主要研究结果如下:
1.香蕉高效再生体系的建立
采用横切薄层培养法建立了巴西蕉的高效再生体系:15min为吸芽的最佳消毒时间;球茎横切薄片出芽率高,为较好的转基因受体;MS+0.2 mg/L NAA+3.5mg/L 6-BA为较适宜的芽增殖培养基;28±1℃黑暗培养15 d后转入28±1℃光照培养,香蕉横切薄层的出芽率较高;
采用悬浮细胞培养法建立了贡蕉品种的再生体系:分别用不同浓度的2,4-D和Picloram的愈伤组织诱导培养基诱导愈伤组织,结果发现4mg/L的Picloram比同浓度的2,4-D诱导的胚性愈伤组织高出一倍以上,但是Picloram诱导的胚性愈伤组织含水量较高,难于建立悬浮系。
2.巴西蕉假茎横切薄片遗传转化体系的建立
通过对植株进行卡那霉素(Kan)敏感性测验,确定选择压为80 mg/L;以薄片为受体,将其放置在MS+0.2 mol·L-1甘露醇固体培养基上高渗处理4h后,浸泡于菌液浓度为OD600=0.6的农杆菌菌液中,侵染20min,共培养5d,当共培养基pH值为5.4时,转化效果最好。在侵染的菌液与共培养基中添加80μmol·L-1AS,重悬液中加入蔗糖100g/L;将薄片浸泡于菌液置摇床上以120rmin-1处理20min,均有助于提高转化效率。
3.转phyB基因巴西蕉植株的分子检测及生物学特性观察
经初步筛选,共获得31株待检测抗性植株。以未转化植株为阴性对照,质粒DNA为阳性对照,phyB基因的两端序列作为特异引物进行PCR扩增。试验结果表明:经PCR扩增后,有7株扩增出的特异条带和阳性对照一致,其他植株及阴性对照均未能扩增出任何条带,这初步表明phyB基因已整合进这些植株的基因组DNA中。经继代培养后,进行移栽种植管理,对其生物学特征的差异进行观察发现抗性植株与未转化植株在颜色与株高上有一定的差异。