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传染性胰腺坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)是引起传染性胰腺坏死病(Infectious pancreatic necrosis, IPN)的病原,IPN是一种以内脏实质器官出血、坏死为主要病理特征的高度接触性、急性传染病。本病对鲑鳟鱼类稚鱼易感,可引起14～70d稚鱼大面积死亡,致死率高达90%。感染后幸存的鱼可终生带毒,成为潜在的感染源。该病流行范围广,发病和致死率高,是我国及世界各国家鲑鳟幼鱼死亡的重要疫病,给水产养殖业造成巨大经济损失。本研究利用RT-PCR方法从感染IPNV-ZYX分离株细胞培养液中扩增出IPNV病毒主要结构蛋白VP2的抗原表位区基因(554～1170bp),命名为VP2COE(616bp),该序列与GenBank上发表的美国毒株AF342728同源性高达99.8%,只在710位碱基A→T。将获得的VP2COE基因定向插入pT30a、pET28a, pProEx HTb、pGEX-6p-1、pCold TF五种不同原核表达载体中,以期获得可溶形式表达的重组蛋白。将重组质粒分别转化大肠杆菌(E.coil),在其中进行了诱导表达,分别获得重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定表明前四种表达载体表达的重组蛋白均以包涵体形式表达,其中以pProEx HTb载体表达的重组蛋白表达量最大,占菌体总量的24%。通过Western Blot进一步分析表明pProEx HTb-VP2COE重组蛋白得到了正确表达,其产物分子量约为30kDa。故选取pProEx HTb-VP2COE重组蛋白作为后续研究的对象。同时,经SDS-PAGE分析pCold TF-VP2COE重组蛋白以可溶形式表达。通过WesternBlot进一步分析表明pCold TF-VP2COE重组蛋白得到了正确表达,其产物分子量约为78kDa。分别将切胶纯化获得的蛋白利用谷胱甘肽还原系统复性；变性法亲和层析获得蛋白后,尿素梯度透析复性,结果表明采用PBS缓冲液体系,在4℃条件下,pH值为8.0,复性液中尿素梯度变化为6M、4M、2M、1.5M、1M、0.5M、0M时,蛋白的复性率最高,回收率可以达到30%。将切胶纯化的pProEx HTb-VP2COE重组蛋白、谷胱甘肽复性的pProEx HTb-VP2COE重组蛋白、变性亲和层析纯化的pProEx HTb-VP2COE重组蛋白、尿素梯度复性pProEx HTb-VP2COE重组蛋白、纯化的pCold TF-VP2COE融合蛋白分别稀释至0.3mg/ml,免疫6～8周龄BALB/c小鼠。产生的抗体经间接ELISA分析,均可与IPNV (ATCC VR-1318)特异反应,抗pCold TF-VP2COE融合蛋白血清、抗pProEx HTb-VP2COE亲和层析变性纯化血清、抗pProEx HTb-VP2COE尿素梯度复性血清、抗pProEx HTb-VP2COE谷胱甘肽复性血清、抗pProEx HTb-VP2COE切胶纯化血清ELISA效价分别为：1：12800、11600、l：6400、1：3200、1：1600。同时中和试验表明,五种血清均具有中和IPNV(ATCCVR-1318)的能力,抗pCold TF-VP2COE融合蛋白血清、抗pProEx HTb-VP2COE亲和层析变性纯化血清、抗pProEx HTb-VP2COE尿素梯度复性血清、抗pProEx HTb-VP2COE谷胱甘肽复性血清、抗pProEx HTb-VP2COE切胶纯化血清中和效价分别为：1：51.29、1：44.67、1：25.70、1：12.88、1：3.02。以上两项结果表明,抗pCold TF-VP2COE融合蛋白血清具有比较好的抗原性。以制备的抗pCold TF-VP2COE融合蛋白血清为一抗、荧光素标记羊抗小鼠IgG为二抗,通过反应条件的优化,建立检测(?)JIPNV抗原的间接免疫荧光(IFA)检测方法。确立的最佳反应条件为：IPNV (ATCC VR-1318)最佳接种浓度和培养条件是IPNV10-5接种EPC细胞,18℃恒温箱中培养24h：细胞固定剂为4%的多聚甲醛；抗pCold TF-VP2COE融合蛋白血清最适工作浓度为1：80倍稀释；FITC标记的羊抗小鼠IgG荧光抗体的最适工作浓度为1：200倍稀释。通过以上条件摸索,确立IPNV间接免疫荧光鉴别诊断方法。用建立的IFA检测方法检测,与IHNV-ZYX分离株、IBDV无交叉反应,具有很好的特异性,且多次重复性试验稳定性较好；以相同方法检测[PNV (ATCC VR-1318),抗pCold TF-VP2COE融合蛋白血清稀释至1：320时仍可见较明显的特异性荧光,表明该检测方法敏感性好,可用于检测IPNV感染的实验室诊断及IPNV在感染细胞中的定位和动态分布研究。应用本试验建立的间接免疫荧光方法对15份临床疑似患有IPN虹鳟肝组织、脾脏组织进行检测,有14份样品呈阳性,阳性率为93%。显示与RT-PCR方法检测结果一致,说明建立的间接免疫荧光方法准确、可靠,可用于IPNV的检测。